卵巢上皮性癌（Epithelial ovarian cancer,EOC）是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一,发现时多属晚期,肿瘤已广泛播散。目前临床规范的EOC治疗方案为手术基础上辅以铂类为主的联合化疗,但其治疗效果一直未能明显改善,五年生存率仅徘徊在30%⁴0%之间,死亡率高居女性生殖系统恶性肿瘤之首位。患者的预后在很大程度上取决于其对化疗的敏感性。即使完成规范的临床治疗,EOC患者中仍有很大一部分最终将面临复发或疾病的持续存在。化疗耐药是临床EOC复发的最主要原因之一,也是影响患者总生存期的重要因素。因此,探索化疗耐药的分子机制、逆转耐药途径,寻找有效的增敏药物和替代铂类药物的治疗方案是改善治疗效果的关键因素。肿瘤细胞的化疗耐药是一个多基因、多因素、多水平共同参与的结果。EOC的组织学分类繁杂,依据2014版卵巢上皮性肿瘤WHO分类,EOC的组织学分类以浆液性癌最为常见,其次为子宫内膜样癌、粘液性癌等。由于不同组织类型的EOC对化疗药物的敏感性不同,因此,研究不同类型EOC的耐药机制,不仅可以预测化疗效果,也可为研制逆转其耐药的新药提供相关理论依据,旨在最终改善卵巢癌患者的预后。三叶因子1（Trefoil factor 1,TFF1）,是三叶因子家族中的一员,与中枢神经调节、胃肠道平滑肌蠕动、粘膜保护以及创伤修复等多种生理过程密切相关。也是近年研究较多的一种小分子多肽,在正常生理条件下主要表达于胃肠道粘膜,相关研究认为TFF1不仅能对胃肠粘膜起到保护和修复的作用,而且在一些肿瘤的发生、发展中亦发挥重要作用。近几年有研究显示TFF1在多种肿瘤组织中有表达,并与肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移及血管生成有关。TFF1尚可以引起女性雌激素失衡,是ER经典通路中一个重要的小分子蛋白,在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用,可导致乳腺癌细胞的增殖和转移。然而,TFF1在不同组织类型EOC细胞铂类耐药中的作用尚未见报道。许多研究发现,1,25-二羟基维生素D3（1,25-dihydroxy vitamin D3,1,25（OH）₂D₃）,即活性维生素D,具有抑制增殖、诱导分化、促进凋亡的作用,从而抑制肿瘤细胞的侵袭、转移。离体实验显示,单独使用卡铂与1,25（OH）₂D₃联合卡铂相比,后者能够更加有效地抑制卵巢上皮性癌细胞SKOV3的细胞周期、抑制癌细胞的增殖。阿霉素是临床常用的非铂类卵巢癌化疗药物,其新剂型脂质体阿霉素（Liposome doxorubicin）既能加强药物的抗癌作用,又能减少其毒副作用,已成为卵巢癌化疗治疗的二线药物。1,25（OH）₂D₃是否有利于增敏脂质体阿霉素对卵巢癌细胞的抑制作用,TFF1是否参与与1,25（OH）₂D₃增敏脂质体阿霉素对卵巢癌细胞的增殖抑制作用,尚未见报道。综上,为研究不同组织学类型的EOC铂类耐药过程中是否有TFF1参与以及TFF1是否参与铂类替代药物对EOC细胞的增殖抑制作用,旨在探讨TFF1是否参与了EOC的铂类耐药并寻找相关耐药替代药物。本研究分为三部分:第一部分TFF1与卵巢粘液性癌细胞铂类耐药关系研究目的:观察TFF1在卵巢粘液性癌细胞的表达及其与铂类耐药的关系,为逆转卵巢粘液性癌铂类耐药提供理论基础。方法:采用RT-PCR和Western blot方法,从m RNA水平和蛋白水平检测卵巢粘液性癌细胞株OMC-3、MCAS的TFF1基因表达,并利用RNA干扰技术,沉默癌细胞的TFF1基因;探讨卵巢粘液性癌细胞株铂类耐药与TFF1表达的关系,以及癌细胞侵袭能力与TFF1表达的关系。以期为逆转铂类耐药提供理论基础。结果:1 TFF1在卵巢粘液性癌细胞的表达经RT-PCR及Western blot显示,卵巢粘液性癌细胞株OMC-3和MCAS TFF1的m RNA和蛋白质水平的呈高表达。2 沉默卵巢粘液性癌细胞TFF1基因干扰RNA（si RNA）作用后,应用Western blot方法检测TFF1蛋白水平,si RNA可以有效的沉默卵巢粘液癌细胞株OMC-3、MCAS的TFF1表达。3 TFF1与卵巢粘液性癌细胞铂类耐药关系3.1 敲降卵巢粘液性OMC-3癌细胞的TFF1表达可缓解铂类耐药性敲降TFF1基因后的卵巢粘液性OMC-3癌细胞,与不同浓度顺铂（2、4、6、8ug/ml）共同孵育后,与对照组相比,两个不同干扰RNA组,在顺铂浓度为4ug/ml和6ug/ml时,OMC-3细胞生存率可明显降低（P<0.01）。提示敲降TFF1表达,可缓解OMC-3细胞的铂类耐药。3.2 敲降TFF1可缓解卵巢粘液性MCAS癌细胞的铂类耐药性卵巢粘液性癌细胞株MCAS,经敲降TFF1表达后,与不同浓度顺铂（2、4、6、8ug/ml）共同孵育,与对照组相比,两个不同干扰RNA组,在顺铂浓度为2ug/ml、4ug/ml和6ug/ml时,MCAS细胞生存率可明显降低（P<0.01）。提示敲降卵巢粘液性癌细胞株MCAS TFF1表达可缓解铂类耐药。综上提示,TFF1在卵巢粘液性癌细胞OMC-3和MCAS中本底高表达,在敲降TFF1基因后,其铂类耐药性可有效缓解,提示TFF1的高表达致卵巢粘液性癌对化疗药物顺铂的耐药性增加,即TFF1增强卵巢上皮性癌细胞的铂类耐药性。4 Transwell侵袭实验4.1 敲降卵巢粘液性OMC-3癌细胞TFF1表达降低其侵袭力与对照组相比,两个不同干扰RNA组经敲降TFF1基因后,OMC-3细胞侵袭的细胞数目明显降低（P<0.01）。提示敲降TFF1表达可降低OMC-3癌细胞的侵袭力。4.2 敲降MCAS细胞TFF1表达降低其侵袭力两个不同干扰RNA组经敲降TFF1基因后,与对照组相比,MCAS细胞侵袭细胞数目均明显降低（P<0.01）。提示敲降TFF1表达后的MCAS细胞侵袭力明显降低。综上提示,TFF1可促进卵巢粘液性癌细胞的侵袭性,表明TFF1的高表达在卵巢粘液性癌的进展中可能发挥促进作用。结论:1 卵巢粘液性癌细胞株OMC-3和MCAS TFF1的m RNA和蛋白质水平呈高表达。2 TFF1的高表达可致OMC-3和MCAS细胞对化疗药物顺铂的耐药性增加。3 TFF1可提高EOC的侵袭性,表明TFF1的高表达在EOC的进展中可能发挥促进作用。第二部分TFF1与卵巢浆液性癌细胞铂类耐药关系研究目的:观察TFF1在卵巢浆液性癌细胞的表达及其与铂类耐药的关系,为逆转卵巢浆液性癌铂类耐药提供理论基础。方法:采用RT-PCR和Western blot方法,从m RNA水平和蛋白水平检测卵巢浆液性癌细胞株Caov-3、SKOV3的TFF1基因表达;构建基因过表达质粒使卵巢上皮性癌细胞过表达TFF1,探讨卵巢浆液性癌细胞株Caov-3铂类耐药与TFF1表达的关系,以及癌细胞侵袭能力与TFF1表达的关系。以期为逆转卵巢浆液性癌铂类耐药提供理论基础。结果:1 TFF1在卵巢浆液性癌细胞的表达经RT-PCR及Western blot显示,与实验第一部分卵巢粘液性癌细胞株比较,卵巢浆液性癌细胞株Caov-3和SKOV3细胞均呈TFF1的m RNA和蛋白质水平的低表达,且Caov-3细胞TFF1的m RNA和蛋白质水平表达更低。2 过表达卵巢浆液性性癌细胞TFF1基因过表达质粒作用后,应用Western blot方法检测TFF1蛋白水平,可有效促使卵巢浆液性癌细胞株Cao-3的TFF1过表达。3 TFF1与卵巢浆液性癌细胞铂类耐药关系TFF1基因过表达处理后的卵巢浆液性癌细胞Caov-3,与不同浓度顺铂（2、4、6、8ug/ml）共同孵育后,与对照组相比,顺铂浓度为4ug/ml和6ug/ml时,Caov-3细胞生存率较前明显升高（P<0.01）。提示TFF1过表达可增强卵巢浆液性Caov-3细胞的铂类耐药性。综上提示,对于卵巢浆液性癌细胞Caov-3,经过表达TFF1处理后,可显著提高癌细胞生存率,提示卵巢浆液性癌细胞对化疗药铂类的耐药性随着TFF1升高而增加。4 Transwell侵袭实验与对照组相比,TFF1基因过表达处理后的Caov-3侵袭的细胞数目明显增加（P<0.01）。提示Caov3细胞过表达TFF1后可增加卵巢浆液性癌细胞Caov-3侵袭力。综上提示,TFF1可促进卵巢浆性癌细胞的侵袭性,TFF1的高表达在卵巢浆液性癌的进展中可能发挥促进作用。结论:1 卵巢浆液性癌细胞株Caov-3和SKOV3细胞均呈TFF1的m RNA和蛋白质水平的低表达。2 TFF1可增加Caov-3的顺铂耐药性。3 TFF1可提高EOC的侵袭性,表明TFF1的高表达在EOC的进展中可能发挥促进作用。第三部分TFF1与卵巢浆液性癌细胞铂类替代用药关系研究目的:观察TFF1与人卵巢浆液性癌细胞株SKOV3铂类替代用药的关系。方法:本研究采用细胞培养、MTT、Western blot、Tunel等方法,观察活性维生素D（1,25（OH）₂D₃）增敏脂质体阿霉素对卵巢浆液性癌细胞株SKOV3的增殖抑制情况、凋亡变化及其相关蛋白PCNA、Caspase-3的表达情况,并采用RT-PCR方法,从m RNA水平探讨卵巢浆液性癌细胞株铂类替代用药与TFF1表达的关系。并观察上述化疗替代用药对卵巢浆液性癌的影响与TFF1的关系。SKOV3细胞增殖的抑制率,依据测定吸光度OD值（A值）,根据下列公式计算:细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100%。结果: 1 MTT法检测SKOV3细胞的增殖抑制率1.1 活性维生素D抑制SKOV3细胞生长具有时间-浓度依赖性:不同浓度活性维生素D(10_-6mmol/L,10_-7mmol/L,10_-8mmol/L)分别处理SKOV3细胞24h、48h和72h后,对SKOV3细胞的增殖抑制作用随药物浓度增大而明显增加,且随着作用时间的延长,生长抑制率也增加,其中,10_-6mmol/L组P<0.01,10_-7mmol/L组P<0.01,10_-8mmol/L组P<0.01,即表现出时间-浓度依赖性。提示活性维生素D抑制SKOV3细胞的增殖呈时间-浓度依赖性。1.2 脂质体阿霉素抑制SKOV3细胞生长具有时间-浓度依赖性:不同浓度脂质体阿霉素（0.5umol/L,1.0umol/L,2.5umol/L,5.0umol/L,10umol/L）分别处理SKOV3细胞24h、48h和72h,对SKOV3细胞的抑制作用随药物浓度增大而明显增加,且随着作用时间的延长,生长抑制率也增加,其中,0.5umol/L组P<0.05,1.0umol/L组P<0.05,2.5umol/L组P<0.01,5.0umol/L组P<0.01,10.0umol/L组P<0.05,即表现出时间-浓度依赖性。提示脂质体阿霉素抑制SKOV3细胞的增殖呈时间-浓度依赖性。1.3 活性维生素D(10_-6mmol/L)、脂质体阿霉素（2.5umol/L）同时用药处理SKOV3细胞24h、48h和72h,细胞生长抑制率分别为47%,52%和60%,明显高于高于单药活性维生素D和单药脂质体阿霉素组,活性维生素D与脂质体阿霉素协同作用明显;差异有统计学意义（P<0.01）,提示活性维生素D增敏脂质体阿霉素对SKOV3细胞的增殖抑制作用呈时间依赖性。2 TUNEL原位凋亡检测2.1 活性维生素D联合脂质体阿霉素组:TUNEL染色阳性细胞体积缩小,细胞核固缩,染色质凝集,呈棕黄色或者黄褐色颗粒状,细胞质着色浅,呈现典型凋亡细胞的形态学特征。2.2 脂质体阿霉素组:可以发现含微核的细胞;2.3 活性维生素D组:可见少量含微核的细胞;2.4 对照组:细胞核大小均匀,界限清楚,呈正常结构,无TUNEL染色细胞。上述结果提示,活性维生素D联合脂质体阿霉素组TUNEL阳性细胞数多于单药活性维生素D、单药脂质体阿霉素及对照组。 3 Western blot法检测相关蛋白表达联合应用活性维生素D、脂质体阿霉素可明显上调Caspase-3蛋白表达水平,降低PCNA蛋白表达水平。提示活性维生素D增敏脂质体阿霉素对SKOV3细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用,凋亡蛋白Caspase-3蛋白和细胞增殖抗原PCNA可能参与了此过程。4 RT-PCR检测TFF1m RNA水平经RT-PCR研究显示,与对照组相比,活性维生素D组、脂质体阿霉素组与联合组TFF1 m RNA水平下降,提示活性维生素D增敏脂质体阿霉素对卵巢浆液性癌细胞SKOV3生长抑制作用与TFF1有关,相关替代药物增敏和抑制作用可能与TFF1水平降低有关。结论:1 不同浓度的活性维生素D、脂质体阿霉素可抑制SKOV3细胞的增殖,且呈时间-浓度依赖性。活性维生素D增敏脂质体阿霉素对SKOV3细胞的增殖抑制作用呈时间依赖性。2 活性维生素D可增敏脂质体阿霉素对SKOV3细胞的诱导凋亡作用。3 活性维生素D增敏脂质体阿霉素对SKOV3细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用,凋亡蛋白Caspase-3蛋白和细胞增殖抗原PCNA可能参与了此过程。4 活性维生素D增敏脂质体阿霉素对卵巢浆液性癌细胞SKOV3生长抑制作用可能有TFF1参与。