研究目的肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是全球范围内高发的一类恶性肿瘤,严重危害人类健康。乙肝病毒感染与肝癌的发生发展及预后密切相关。据临床调查资料显示,约10%的病毒性肝炎会发展为慢性活动性肝炎,50%的慢性活动性肝炎可能发展为肝硬化,9.9%-16.6%的肝硬化会发展恶化成肝癌。我国的肝癌发病率及发病人数居世界首位,目前慢性HBV感染的治疗药物主要包括核苷(酸)类似物(如阿德福韦酯、拉米夫定等)和干扰素α,可有效抑制病毒的复制,延缓疾病进展,但也存在一些缺点,如核苷(酸)类似物治疗停药后易复发、长期治疗易出现病毒耐药,干扰素治疗也存在许多不良反应,不能彻底清除HBV cccDNA并完全治愈HBV。而近年来,出现的靶向破坏HBV生命周期HBV cccDNA的技术(CRISPR/Cas9),虽尚未应用到临床,但为实现慢性乙肝的治愈提供了可能。已有研究发现,Stat3作为癌基因在许多血液性和实体肿瘤组织中是高度表达和持续活化的状态,并且在HBV感染的肝脏中也呈现出高表达。近年来,在体外和体内动物实验中,利用小干扰RNA、诱骗寡核苷酸等技术直接从mRNA水平抑制Stat3蛋白的合成,均显示出良好的抗肿瘤效果。目前已知HBV感染是导致肝癌发生的重要危险因素,其中HBV x基因是HBV基因组中四个开放读码框中最小的,由462个核苷酸组成,其最容易整合到宿主基因组中,它编码的x蛋白对HBV的转录发挥重要作用。在HBV诱导HCC中,HBx和Stat3能够相互作用,例如HBx能够促进Stat3分子的磷酸化,磷酸化的Stat3进入细胞核内进一步促进了 HBV的无限复制,引起疾病的恶化癌变。目前研究发现,对Stat3及HBx基因单独沉默均显现出良好的抗肿瘤效果,那么将二者联合是否出现“1+1＞2”的效果呢,本文首先对此问题进行了研究。肝纤维化是细胞外基质过度沉积引起,如果此种状态持续存在,容易向肝癌转化。逆转肝纤维化进程,可有效降低肝癌的发生。有研究表明,一类广泛用于治疗心血管疾病的药物——钙离子通道拮抗剂对肺纤维化有保护作用,它还可以抑制肝纤维化和肝硬化的进程,显著降低肝硬化患者的门静脉压力和血清中透明质酸水平。然而,目前尚缺乏尼莫地平(Nimodipine)在早期肝纤维化中的疗效和机制的研究。因此,本文对尼莫地平在硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)诱导肝纤维化小鼠模型中的作用及其发挥作用的机制进行探究。本研究分为两部分:首先利用CRISPR/Cas9技术构建双功能载体,同时沉默Stat3和HBx基因,并对其治疗效果进行研究;另一方面,本文对钙离子通道拮抗剂尼莫地平在TAA造模的肝纤维化小鼠中的治疗效果进行探讨。第一部分 Stat3和HBx双靶向CRISPR/Cas9载体的构建及其对HBV相关肝癌的治疗作用研究方法1.用Bsa I对PX333空载体进行酶切,并通过琼脂糖凝胶电泳回收线性片段,同时对合成的靶向Stat3基因的3对sgRNA及靶向HBx基因的2对sgRNA上下游碱基序列进行退火处理,使其形成互补配对双链。T4连接酶连接回收片段和互补双链,转化细菌感受态,并选择单克隆进行测序。2.采用免疫荧光检测PX333载体Flag标签蛋白的表达;Western Blot检测Stat3蛋白的表达。3.采用MTT检测转染Stat3沉默载体后HepG2.2.15细胞的增殖情况;活细胞检测仪连续监测转染Stat3沉默载体后HepG2.2.15细胞的汇合度。4.通过划痕实验检测转染Stat3沉默载体后HepG2.2.15细胞的迁移情况;qPCR检测 VEGF、MMP9、IL-10、TGF 的表达。5.采用PCR扩增转染Stat3-sgRNA1及Stat3-sgRNA2载体所针对的基因组靶位点附近序列,经过T7E1酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳以检测靶位点突变,同时将扩增后的靶位点序列连接M5 Hiper pTOPO-Blunt测序质粒,转化细菌感受态后,并挑单克隆测序。6.采用Western Blot检测转染HBx沉默载体后HBx及Stat3蛋白的表达;采用qPCR检测HBx基因的表达水平;采用ELISA方法检测HepG2.2.15细胞培养上清中HBsAg的分泌水平。7.首先采用BbS I对HBx-sgRNA2载体进行酶切,并通过琼脂糖凝胶回收线性片段。然后对合成的靶向Stat3基因的sgRNA1序列及靶向HBx基因两种sgRNA上下游碱基序列进行退火处理,使其形成互补配对双链。最后将回收的线性片段和sgRNA互补配对双链经过T4连接酶连接,转化细菌感受态,并选择单克隆对构建的串联载体进行测序。8.采用CCK8检测单沉默Stat3载体Stat3-sgRNA1,单沉默HBx载体HBx-sgRNA1 和 HBx-sgRNA2 以及串联载体 Stat3-sgRNA1-HBx-sgRNA2、HBx-sgRNA1-HBx-sgRNA2、HB x-sgRNA2-HBx-sgRNA2 转染 HepG2.2.15 细胞后对细胞增殖的影响;活细胞检测仪连续监测以上多种沉默质粒转染组HepG2.2.15细胞的汇合度。9.采用AnnexinV-PI染色检测不同质粒转染组HepG2.2.15细胞的凋亡情况。结果1.测序结果显示,3种靶向Stat3的sgRNA序列和2种靶向HBx的sgRNA序列成功插入PX333载体。2.免疫荧光结果显示,转染CRISPR/Cas9质粒能够在HepG2.2.15细胞中正常表达,Western Blot分析结果显示,靶向Stat3的sgRNA1和sgRNA2序列均可以减少Stat3蛋白的表达。3.MTT结果靶向Stat3-sgRNA1序列能够抑制HepG2.2.15细胞的增殖,活细胞检测仪结果显示出相同的结果,同时sgRNA2序列亦可以影响HepG2.2.15细胞的增殖。4.划痕实验显示,靶向Stat3-sgRNA1和sgRNA2质粒在第24h及36h时间点均被观察到抑制HepG2.2.15细胞迁移的情况。qPCR结果显示,Stat3-sgRNA1和Stat3-sgRNA2均可以降低VEGF、MMP9的表达,具有降低IL-10、TGF表达的趋势。5.电泳结果显示Stat3-sgRNA1和Stat3-sgRNA2载体能够引起Stat3 靶位点基因的碱基突变,从而被T7E1核酸酶酶切开。测序结果显示,转染Stat3-sgRNA1及Stat3-sgRNA2后,HepG2.2.15细胞Stat3靶位点附近发生了基因编辑,存在碱基突变。6.HBx-sgRNA2可以明显减少HBx蛋白的表达,HBx-sgRNA1可以减低HBx基因水平的表达。ELISA结果显示,HBx-sgRNA1和sgRNA2均可减少HepG2.2.15细胞培养上清中的HBsAg释放。7.测序结果显示,成功在HBx-sgRNA2载体上串联入Stat3-sgRNA1、HBx-sgRAN1 或 HBx-sgRAN2。8.CCK8 结果显示Stat3-sgRNA1、Stat3-sgRNA1-HBx-sgRNA2、HBx-sgRNA1-HBx-sgRNA2、HBx-sgRNA2-HBx-sgRNA2 均能够抑制HepG2.2.15细胞的增殖。活细胞检测仪结果显示Stat3-sgRNA1-HBx-sgRNA2(Stat3和HBx双靶向载体)能够显著抑制HepG2.2.15细胞的增殖。9.流式细胞仪检测结果显示,Stat3-sgRNA1-HBx-sgRNA2、HBx-sgRAN 1-HBx-sg-RNA2、HBx-sgRAN2-HBx-sgRNA2 均可以明显促进细胞的凋亡,其中Stat3和HBx双靶向促凋亡效果最明显,对早期及晚期凋亡进行进一步分析发现具有相同的趋势。结论及意义1.该研究成功构建了单靶向Stat3的3种及靶向HBx的2种CRISPR/Cas9载体并对其沉默效果进行评价,确定Stat3-sgRNA1能够抑制HepG2.2.1 5细胞的增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞的迁移;HBx-sgRNA2可以抑制HBx蛋白的表达,减少HBsAg的产生。2.该研究成功构建了 3 种不同策略的串联 sgRNA 载体:Stat3-sgRNA1-HBx-sgRNA2、HBx-sgRAN1-HBx-sg-RNA2、HBx-sgRAN2-HBx-sgRNA2。其中 Stat3-sgRNA1-HBx-sgRNA2(Stat3.和 HBx 双靶向载体)显著抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。3.该研究本文利用CRISPR/Cas9新型基因编辑技术,同时沉默与肝癌发生发展密切相关的2种分子:Stat3和HBx,证明它能抑制HepG2.2.15细胞的增殖和迁移并促进HepG2.2.15细胞的凋亡。为进一步研究Stat3和HBx联合治疗HBV相关的肝脏疾病提供了新策略和实验依据。第二部分 尼莫地平对TAA诱导肝纤维化的保护作用研究方法1.通过腹腔注射TAA构建小鼠肝纤维化模型,同时进行尼莫地平的治疗,一定时间后处死小鼠,利用Sirus Red染色检测肝脏胶原沉积情况;采用Western Blot检测I型胶原及α-SMA的表达。2.采 qPCR 检测 α-SMA、Col1a1、Acta2、AFP、GPC-3、TIMP1、MMP2、MMP9、TGF-β、IL-10、TNF-α 基因表达。3.HE染色检测肝脏淋巴细胞浸润情况,并用试剂盒测定小鼠血清中ALT、AST水平。4.用Western Blot检测MAPK信号通路相关蛋白的表达。5.收集脾脏、肝脏并称重,计算脾脏、肝脏与体重的比值。对肝脏单个核细胞进行计数;用流式细胞仪测定小鼠肝脏及脾脏中NK细胞和NKT细胞的绝对数量和比例;对分选出的肝脾单个核细胞进行体外培养,经尼莫地平处理后测定NK、NKT细胞比例及活化水平,同时测定NK活化性标志NKG2D分子的表达,NK分泌IFN-γ、CD107a的水平。6.使用流式细胞仪检测肝脏和脾脏中总T淋巴细胞、CD4+T细胞亚群和CD8+T细胞亚群的绝对值,比例和活化,计算CD4+T/CD8+T 比值。7.使用流式细胞仪测定肝脏和脾脏中MDSC的比例。8.制作冰冻切片采用免疫荧光染色检测肝星状细胞的活化和凋亡。9.采用MTT检测不同剂量尼莫地平处理后LX2细胞的增殖情况;活细胞检测仪连续监测不同剂量尼莫地平处理后LX2细胞的汇合度;PI染色检测尼莫地平处理后LX2细胞的周期。10.采用AnnexinV-PI染色检测不同剂量尼莫地平处理LX2细胞24h后细胞的凋亡率,Western Blot 检测 Bax、Caspase3、Bcl-xl、p-JNK、JNK 的表达水平;qPCR检测凋亡及周期相关基因Bcl-2、Bcl-xl、Bax、CyclinDl、TGF-β等的mRNA水平。结果1.Sirus Red染色结果显示,TAA造模组与对照组相比,肝脏阳性染色面积增加,并且在血管周围观察到胶原沉积。尼莫地平治疗后,小鼠肝脏胶原沉积显著降低,Western Blot结果显示,与Ctrl模型组相比,尼莫地平治疗组降低α-SMA、Col1a1的蛋白的表达。2.qPCR结果显示,同TAA组相比,尼莫地平治疗后,肝癌及纤维化相关的分子 α-SMA、Col1a1、TIMP1、AFP、GPC-3 和免疫抑制性分子 TGF-β、TNF-α、IL-10基因表达水平明显降低,Acta2分子呈下降趋势,基质金属蛋白酶MMP2和MMP9表达增加。3.HE染色的结果显示,TAA造模组与对照组相比,肝脏血管周围存在少量炎性细胞浸润,肝细胞部分呈胞质空泡样结构及小叶间胆管增生等病理现象;尼莫地平治疗后,小鼠肝脏中的炎性细胞浸润减少。同时,TAA造模组与对照组相比,显著升高血清中ALT、AST的水平,尼莫地平治疗组ALT、AST水平恢复正常。4.Western Blot结果显示,TAA模型组与对照组相比,升高肝脏磷酸化JNK、Stat3等蛋白的表达水平,尼莫地平处理后相应的蛋白质表达下调,但Erk和p38信号通路不受显著影响。5.尼莫地平给药可以逆转TAA造模引起的肝脏、脾脏与体重的比值。流式细胞仪测定结果显示,TAA组和尼莫地平治疗组单个核细胞总数均显著增加。尼莫地平组较TAA组NK、NKT细胞总数明显增加。进一步分析发现,NK细胞比例增加,NKT 比例低于空白对照组。但尼莫地平在体外无活化小鼠的NK及NKT细胞的作用,这可能与体内微环境的不同所致。6.流式细胞仪测定结果显示,TAA可以上调CD8+T细胞占单个核淋巴细胞的比例,尼莫地平治疗后CD8+T 比例明显下降;同时,TAA可以下调CD4+T细胞比例,尼莫地平治疗增加CD4+T细胞的比例,这种现象在脾脏中更加明显。并且,尼莫地平治疗可以降低CD8+T、CD4+T的活化水平,逆转TAA导致的CD4+/CD8+T 比值下降的现象,在脾脏中也观察到类似的现象。7.流式细胞术检测结果显示,TAA处理会上调MDSCs的比例,尼莫地平治疗能显著抑制MDSC的比例。8.冰冻切片免疫荧光结果显示,TAA模型组α-SMA表达明显高于对照组,而尼莫地平治疗后α-SMA的表达降低至正常水平。α-SMA和TUNEL免疫荧光共定位揭示尼莫地平治疗可诱导小鼠肝脏中肝星状细胞的凋亡。9.MTT结果显示,尼莫地平在较低浓度10nM时就能抑制LX2细胞的增殖,并且呈现浓度依赖性;活细胞监测仪显示出相同的结果。PI染色测定周期结果显示,尼莫地平处理后使得LX2细胞G1期比例明显增加,S期和G2期细胞比例减少,细胞周期阻滞在G1期。在较高尼莫地平浓度(50nM)处理LX2细胞时,可以观察到明显的凋亡峰。10.AnnexinV-PI染色结果显示,尼莫地平促进人肝星状细胞系LX2细胞的凋亡,并且具有浓度依赖性,在较低剂量10nM时不产生促凋亡作用。Western Blot结果显示,随尼莫地平剂量的增加,促凋亡蛋白Bax、Caspase3、p-JNK、JNK蛋白表达增加,抑制凋亡蛋白Bcl-xl表达降低。qPCR检测结果显示,Bcl-2、Bcl-xl、TGF-β表达降低,CyclinD1表达有降低的趋势,Bax有上升趋势等。以上结果揭示尼莫地平能够抑制肝星状细胞的增殖和周期,并通过激活JNK通路促进LX2细胞的凋亡。结论及意义1.本研究发现尼莫地平可以减少TAA造模小鼠肝脏部位胶原的沉积,减少炎症反应,降低炎症通路相关蛋白的表达,进而起到抗纤维化的作用。2.本研究发现尼莫地平可增加NK、NKT细胞的数量,改变肝脏CD4+T、CD8+T比例及CD4+T/CD8+T比值,同时减少免疫抑制细胞MDSC占单个核淋巴细胞的比例,影响免疫微环境,呈现抗纤维化作用。3.本文通过免疫荧光染色和体外实验揭示尼莫地平抗纤维化的机制可能是抑制肝星状细胞的活化和促进肝星状细胞的凋亡,并且促凋亡作用是通过激活JNK通路。4.本文为钙离子通道拮抗剂用于肝纤维化研究提供了实验依据,为开发老药的新用途提供了新思路。