【摘 要】
：
褐藻胶裂解酶降解褐藻胶制备褐藻寡糖,褐藻寡糖可以应用于医药、农业、食品等行业。由于野生菌株存在酶蛋白表达量少、分离困难等问题,所以难以实现大规模的工业化生产。本文构建了胞内表达的褐藻胶裂解酶E226K,通过定点突变以及关键位点的饱和突变等方法提高了酶蛋白的热稳定性和催化活力,并基于分子动力学模拟的手段,揭示其催化特性发生改变的结构机理。主要研究结果如下:1.褐藻胶裂解酶E226K的理论分子质量为2
论文部分内容阅读
褐藻胶裂解酶降解褐藻胶制备褐藻寡糖,褐藻寡糖可以应用于医药、农业、食品等行业。由于野生菌株存在酶蛋白表达量少、分离困难等问题,所以难以实现大规模的工业化生产。本文构建了胞内表达的褐藻胶裂解酶E226K,通过定点突变以及关键位点的饱和突变等方法提高了酶蛋白的热稳定性和催化活力,并基于分子动力学模拟的手段,揭示其催化特性发生改变的结构机理。主要研究结果如下:1.褐藻胶裂解酶E226K的理论分子质量为29.3 k Da,等电点4.42,由较多的β-折叠和一个螺旋组成一种无信号肽、无跨膜区的亲水性、稳定性好的酶蛋白。构建了胞内表达菌株BL21（DE3）-p ET-28a（+）-E226K,于16℃、IPTG终浓度0.05 mmol/L进行诱导表达24 h。采用DNS法测定酶活力,考马斯亮蓝G250法测定蛋白含量,计算E226K的比活力为80.41 U/mg。2.以重组质粒pET-28a（+）-E226K为模板,根据催化腔附近氨基酸的性质、“盖子”结构以及催化腔入口的空间位阻,采用定点突变以及关键位点的饱和突变等方法,筛选到比活力提高274%的突变体I38T/R121V。3.E226K和突变体I38T/R121V的最适反应温度和最适反应p H值均为55℃、p H7;Na+、K+、Mg2+对两者均有促进作用,Co2+、Mn2+、Cu2+、Ag+有明显抑制作用;E226K的最适Na Cl浓度为1.0 mol/L,突变体I38T/R121V的最适Na Cl浓度为0.5 mol/L;突变体I38T/R121V对EDTA的敏感度略高于E226K。4.最适温度55℃（328K）时,突变体I38T/R121V的半衰期(t1/2)较E226K提高了177%;Km值、Kcat值、Kcat/Km分别是E226K的61.5%、3.6倍、5.8倍,说明突变后酶蛋白的催化效率明显提高。5.分子动力学模拟表明:突变提高了酶蛋白Loop1（A35-G44）氨基酸残基及催化腔入口处组成α-螺旋的氨基酸残基的柔性,优化了突变位点附近的能量分布,减小了糖链非还原端结合位点的空间位阻,增加了活性中心同底物的相互作用力,导致亲合能提高,底物更易结合在催化腔中,有利于质子的传递和水解的发生,从而提高了酶蛋白的催化效率。同时,酶蛋白的分子内相互作用力更为复杂,骨架的刚性略有提高,促使突变体具有更强的热稳定性。
其他文献
血管紧张素转化酶（ACE）是引起高血压的关键蛋白,但有研究发现,其还可能参与了炎症性肠病（IBD）的发生过程。IBD是一种病因不明的复杂的慢性炎症疾病,对人类的生活造成严重的负担。而当前治疗IBD的药物,大多具有副作用而且效果不理想。因此,探索毒副作用小并能有效治疗肠炎的新药物,一直是人们追寻的目标。本课题将以安全性高的抗炎活性肽K肽作为目标药物,进行其对ACE的功效研究,并探索K肽治疗肠炎的作用
创伤敷料在伤口护理、愈合以及功能恢复方面发挥了重要作用。然而,大多数敷料难以在湿润的环境下与伤口紧密贴合,因此很难发挥伤口组织渗液吸收功能,同时影响了敷料负载活性成分的释放和吸收。此外,单一功能的敷料也难以满足伤口在整个愈合过程中的需求。本课题受海洋生物贻贝水下粘附的启发,制备了多巴胺改性透明质酸（DOPA-HA）,并以其和明胶为基底材料,制备了一种具有良好粘附性能的多功能复合海绵敷料。本课题对所
生物合成的异胡椒醇做为一种天然香料,具有很高的应用价值。目前国内外还未见利用工程菌株转化生产异胡椒醇的报道。柠檬烯-3-羟化酶（LIM3H）是特异性催化底物柠檬烯生成异胡椒醇的酶,与细胞色素P450还原酶（CPR）协同发挥作用,本文对LIM3H与拟南芥细胞色素P450还原酶（ATR）的氨基酸疏水区做了适当的修饰,使LIM3H与ATR能够在大肠杆菌中异源表达,最终实现了异胡椒醇的全细胞转化。主要研究
糖基转移酶,作为植物体内天然产物修饰的关键酶,在天然产物合成中扮演着至关重要的角色。金线莲苷、红景天苷、人参皂苷等中药活性成分,在生物合成过程中都需要糖基转移酶的修饰。植物中普遍存在着糖基转移酶,但是利用传统方法研究这些酶既费时又具有挑战性,目前只有一小部分糖基转移酶已被完整表征,极大地限制了植物天然产物的生物合成研究。因此,本研究报告了一种快速且高通量的方法,即利用无细胞转录翻译系统（Cell-
组织工程皮肤是由种子细胞和支架材料在体外构建的皮肤替代物,其在医疗、化妆品、制药和皮肤病理学研究等领域具有重要应用价值。然而,目前大多数组织工程皮肤是基于胶原凝胶构建而成的,还普遍存在力学性能差、易收缩和不稳定等问题,极大限制了组织工程皮肤的应用范围和效果。本课题以硫代透明质酸（HASH）和甲基丙烯酰化明胶（Gel MA）为基质材料,通过复合交联策略,制备了具有力学性能可调和生物可适应性的互穿网络
本论文以开发用于生物医学成像的新型纳米材料为主要研究内容,通过合理的设计,采用简便环保的方法合成了两种安全、高效的纳米材料,并将其成功地应用在生物医学成像探针中。本论文分为三章。包括以下内容:第一章,简要介绍了纳米材料对生物医学成像的重要意义,并详细叙述了铜基无机-有机杂化材料和锰基纳米材料的制备和应用。同时简要介绍了X射线成像技术、磁共振成像、光声成像以及光热成像的最新研究成果,最后简要阐述了本
连江鲍鱼（Haliotis discus hannai）壳的形成是典型的生物矿化过程,生物矿化蛋白对壳的形成及其结构特性起着关键作用。本论文通过从外套膜和内脏团转录组文库中筛选出外套膜高表达的生物矿化相关基因,并进一步探究候选矿化基因的生物矿化功能。通过从外套膜和内脏团转录组文库比对中筛选出外套膜高表达基因。进一步筛选出与生物矿化相关unigenes共91条,从中鉴定出30个与生物矿化相关基因。其
漆酶（EC 1.10.3.2）,是一类含铜的多酚氧化酶,也是一种底物广泛的绿色催化剂,具有广阔的工业应用前景。Cerrena unicolor 87613,具有发酵周期短、产酶量高等特点。本课题研究了不同碳氮源对C.unicolor 87613漆酶产量及漆酶基因转录水平的影响,为获得性质优良的不同漆酶同工酶,将lacB、lacD及lacG三条漆酶基因导入毕赤酵母X33进行异源表达,对重组漆酶进行酶
生物活性肽是一类肽类化合物。人体摄入的蛋白质经酶水解后,主要以肽的形式被消化吸收。生物活性肽具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等作用。本实验旨在探究两类生物活性肽:人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）培养上清经超滤处理后得到小于3kDa的分泌多肽（以下简称H-peptides）与重组Ⅲ型、ⅩⅪ型胶原蛋白
DiGeorge综合征是人类最常见的由拷贝数变异（Copy number variations,CNVs）引起的微缺失综合征,发病率极高。患者常伴随多种不同程度的症状,严重影响生活质量。目前,普遍认为DiGeorge综合征的发病机理与同源序列间非等位基因同源重组（Non-allelic homologous recombination,NAHR）事件相关,但该理论未得到证实。而DNA双链断裂（Do