【摘 要】
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漆酶（EC 1.10.3.2）,是一类含铜的多酚氧化酶,也是一种底物广泛的绿色催化剂,具有广阔的工业应用前景。Cerrena unicolor 87613,具有发酵周期短、产酶量高等特点。本课题研究了不同碳氮源对C.unicolor 87613漆酶产量及漆酶基因转录水平的影响,为获得性质优良的不同漆酶同工酶,将lacB、lacD及lacG三条漆酶基因导入毕赤酵母X33进行异源表达,对重组漆酶进行酶
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漆酶（EC 1.10.3.2）,是一类含铜的多酚氧化酶,也是一种底物广泛的绿色催化剂,具有广阔的工业应用前景。Cerrena unicolor 87613,具有发酵周期短、产酶量高等特点。本课题研究了不同碳氮源对C.unicolor 87613漆酶产量及漆酶基因转录水平的影响,为获得性质优良的不同漆酶同工酶,将lacB、lacD及lacG三条漆酶基因导入毕赤酵母X33进行异源表达,对重组漆酶进行酶学性质表征及黄曲霉毒素降解应用研究,通过分子对接技术分析重组漆酶与不同底物的作用模式。C.unicolor 87613漆酶基因的转录和表达受到不同碳氮源的影响,蔗糖和蛋白胨均有利于其转录与漆酶合成。将lacB、lacD及lacG进行异源表达,得到漆酶同工酶rLacB、rLacD和rLacG。测得酶活分别为300.67、241.56、46.89 U/L,最适反应pH分别为3.0、2.5、3.0,在pH 5.0-8.0范围内均较稳定,最适反应温度分别为60、55和40℃,其中,rLacB具较高热稳定性。rLacB对低于25%的6种水溶性有机溶剂及抑制剂EDTA、Tween 80及Triton X-100具较强耐受性。Ni2+对rLacG有明显促进作用。rLacD与ABTS亲和力较高,Km为6.41μM。相较w LacB（wild LacB,从C.unicolor 87613发酵液中纯化得到）,rLacB对ABTS最适pH向酸性转移,pH耐受范围扩增,最适温度提升15℃,温度稳定性上升,对ABTS的亲和力增加。rLacB、rLacD及rLacG降解AFB1、AFG1最适pH为7.0,rLacB和rLacD对AFB1降解最适温度为45℃,对AFG1降解的最适温度落在45-55℃,rLacG降解AFB1、AFG1最适温度为30℃。在最适降解条件反应48 h后,rLacD（20 U/mL）对AFG1的降解率达90.36%。动力学结果表明,rLacD与AFB1、AFG1具较高亲和力,Km分别为14.70、13.98μM。分子对接结果显示,相较于rLacB和rLacG,rLacD中Asp453与ABTS磺酸基上氧原子形成氢键,Ser113与AFB1香豆素内酯环的氢键作用,Arg336和His111分别与AFG1香豆素环及双呋喃环形成氢键,可能使其与三种底物具更高亲和力。本课题成功获取了C.unicolor 87613的漆酶同工酶,并对其性质及与底物的作用方式进行研究,为后续开发优质漆酶及漆酶的应用奠定基础;对黄曲霉毒素B1和G1降解条件进行探索,将为漆酶在生物降解上的应用提供理论基础。
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