【摘 要】
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生物合成的异胡椒醇做为一种天然香料,具有很高的应用价值。目前国内外还未见利用工程菌株转化生产异胡椒醇的报道。柠檬烯-3-羟化酶（LIM3H）是特异性催化底物柠檬烯生成异胡椒醇的酶,与细胞色素P450还原酶（CPR）协同发挥作用,本文对LIM3H与拟南芥细胞色素P450还原酶（ATR）的氨基酸疏水区做了适当的修饰,使LIM3H与ATR能够在大肠杆菌中异源表达,最终实现了异胡椒醇的全细胞转化。主要研究
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生物合成的异胡椒醇做为一种天然香料,具有很高的应用价值。目前国内外还未见利用工程菌株转化生产异胡椒醇的报道。柠檬烯-3-羟化酶（LIM3H）是特异性催化底物柠檬烯生成异胡椒醇的酶,与细胞色素P450还原酶（CPR）协同发挥作用,本文对LIM3H与拟南芥细胞色素P450还原酶（ATR）的氨基酸疏水区做了适当的修饰,使LIM3H与ATR能够在大肠杆菌中异源表达,最终实现了异胡椒醇的全细胞转化。主要研究内容包括:1.提取胡椒薄荷的总RNA并反转录为c DNA,以NCBI Gene Bank中已有的LIM3H序列为模板设计引物,通过PCR扩增得到LIM3H基因,命名为BH;另外根据文献中LIM3H序列,通过密码子优化后人工合成PM2基因。2.将BH和PM2构建到多拷贝质粒p ET-27b（+）和p ETDuet-1并转化到BL21（DE3）中,在诱导温度16～37℃,IPTG浓度0.2～1 m M,诱导时间8～16h条件下通过蛋白电泳均未检测到BH和PM2基因的过表达。3.对BH和PM2的N端疏水区分别进行截短及添加17α短肽、2B1短肽的亲水性修饰,检测到LIM3H过表达,最佳表达条件为诱导温度16℃,IPTG浓度0.2 m M,诱导时间16 h,其中17α修饰的PM2表达量最高,利用CO差谱法测得LIM3H浓度为278 nmol/L。4.以来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的NADPH-细胞色素P450还原酶（ATR）为电子传递蛋白,分别构建了N端疏水区截短的ATR（tr ATR）与LIM3H的共表达和融合表达的载体,在BL21-Fus-tr PM2-tr ATR、BL21-Fus-17αtr PM2-tr ATR、BL21-Fus-2B1tr PM2-tr ATR、BL21-Fus-tr BH-tr ATR、BL21-Fus-17αtr BH-tr ATR等重组菌中检测到了融合蛋白的上清表达。5.以融合表达的重组菌株为生物催化剂,以柠檬烯为底物,在几种融合表达的菌株全细胞催化反应中均检测到异胡椒醇的生成,其中产量最高的是BL21-Fus-17αtr PM2-tr ATR,异胡椒醇的产量为1.94 mg/L。本研究首次尝试了LIM3H与ATR融合表达的全细胞催化,为天然异胡椒醇的生产提供了新的方法。
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