奶牛生产中,为提高产奶量,在日粮中添加高精料日粮,但长时间饲喂高精料会诱发瘤胃内革兰氏阴性菌大量死亡和崩解,一些抗原肽从细菌表面脱落,在瘤胃内产生大量脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）、细菌二肽和细菌三肽（合称细菌小肽）,引发一些营养代谢性疾病和系统性促炎症反应,如瘤胃炎、肝脓肿、蹄叶炎、间歇性腹泻等,并导致产奶量下降,给奶牛养殖业造成巨大的经济损失。之前的研究报道,主要集中在LPS和短链脂肪酸（Short chain fatty acid,SCFA）对瘤胃上皮炎症的影响,以及证明PEPT1负责转运和吸收细菌小肽进入小肠细胞,进而引起小肠急速炎症反应和严重的结肠炎。然而,PEPT1能否介导细菌小肽调控奶牛瘤胃上皮细胞（Bovine rumen epithelial cells,BRECs）的炎症反应还未有研究。因此,本研究旨在通过荧光定量PCR、基因敲除、转录组分析、Western blots、免疫荧光等方法,深入探讨PEPT1调控BRECs炎症反应的分子机制,为研究BRECs炎症反应和免疫应答提供理论依据。第2章高精料瘤胃液对奶牛瘤胃上皮细胞炎症反应的影响本试验旨在研究高精料瘤胃液对奶牛瘤胃上皮细胞炎症反应的影响。试验分为两个组:对照组瘤胃液组（即正常饲喂组）（Control,Con）和高精料瘤胃液组（High concentrate rumen fluid,HCRF）,各自培养细胞6 h,每组6个重复。培养6 h之后,细胞被收集提取细胞总RNA和细胞总蛋白。结果表明,与对照组相比,高精料日粮瘤胃液极显著提高（P＜0.05）BRECs促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达量。此外,高精料日粮瘤胃液能显著促进（P＜0.05）BRECs的CCL2、CCL20、-CXCL2、CXCL3、CXCL8和CXCL9趋化因子表达。高精料日粮瘤胃液显著降低（P＜0.05）TLR2和TLR4表达量,但并末改变TLR4接头蛋白CD14、MD2和MyD88以及下游信号通路IRAK1和TRAF6表达量。值得注意的是,高精料日粮瘤胃液显著上调BRECs PEPT1的表达量（P＜0.05）,暗示PEPT1可能转运高精料瘤胃液中的细菌小肽进入细胞,引起炎症反应。高精料日粮瘤胃液显著促进（P＜0.05）BRECs的MDA和H2O2上调,然而,SOD、GSH-Px和T-AOC含量被极显著减少（P＜0.05）。结果表明,高精料日粮瘤胃液能够促进瘤胃上皮细胞的炎症反应以及加强免疫应答。此外,高精料日粮瘤胃液对奶牛瘤胃上皮具有损伤作用。第3章转录组分析PEPT1敲除的BRECs mRNA差异基因表达本试验旨在利用转录组测序技术来研究PEPT1敲除后的BRECs的mRNA差异基因表达。通过CRISPR/Cas9系统获得稳定敲除PEPT1的BRECs。经过TA克隆并进行测序,结果显示PEPT1敲除获得3个亲本,其中,两个亲本为有效敲除。通过Western blots检测,与野生型对比,敲除型BRECs几乎不表达PEPT1,说明敲除成功。试验分为两个组:野生型BRECs和PEPT1敲除型BRECs。通过全转录组分析野生型BRECs和PEPT1敲除型BRECs转录水平的差异基因表达规律。结果表明,与野生型BRECs相比,PEPT1敲除型BRECs的IL-6促炎症因子表达量被极显著下调（P＜0.001）,CCL2和CCL5趋化因子表达量被极显著下调（P＜0.001）。值得注意的是,大部分CXCL型的趋化因子表达量都被下调,其中CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL9、CXCL12和CXCL16趋化因子表达量被极显著下调（P＜0.001）。以上结果暗示,PEPT1能够调控BRECs的炎症反应。与野生型对比,PEPT1敲除型BRECs,涉及炎症反应信号通路中关键信号分子IRAK4激酶（P＜0.05）和IRF1转录因子（P＜0.005）表达量被显著下调,但PEPT1和IRAK4激酶、IRF1转录因子的表达并不呈显著正相关。此外,涉及模式识别受体的NOD2被显著下调（P＜0.05）,但并未改变NOD1受体的表达量。NOD2受体信号通路下游的关键激酶RIPK2表达量也极显著下调（P＜0.001）,但并未改变RIPK1和RIPK3激酶的表达量。PEPT1敲除没有改变BRECs的ERK2、ERK3、ERK4、ERK5激酶表达量,但ERK1的表达量被极显著下调（P＜0.01）。此外,NF-κB1转录因子被极显著下调（P＜0.001）。更为重要的是,PEPT1与ERK1激酶和NF-KB1转录因子呈极显著正相关（P＜0.01）。结果表明,PEPT1调控BRECs炎症反应可能通过MAPK信号通路中ERK1激酶和NF-κB1转录因子介导实现的。第4章PEPT1介导高精料日粮瘤胃液调控奶牛瘤胃上皮细胞炎症反应本试验旨在研究PEPT1介导高精料日粮瘤胃液调控奶牛瘤胃上皮细胞炎症反应。试验分为四个组:野生型BRECs、敲除PEPT1 BRECs、添加10%HCRL刺激野生型BRECs和添加 10%HCRL刺激敲除PEPT1 BRECs。结果证明,与10%HCRL刺激野生型BRECs相比,10%HCRL刺激敲除PEPT1的BRECs IL-1β和TNF-α的表达量被极显著下调（P＜0.01）。与野生型BRECs相比,添加10%HCRL刺激BRECs CXCL2和CXCL3趋化因子的表达量被极显著上调（P＜0.01）。与添加10%HCRL刺激BRECs相比,10%HCRL刺激敲除PEPT1的BRECs CCL2、CXCL3和CXCL9趋化因子的表达量被显著下调（P＜0.05）。此外,与添加10%HCRL刺激BRECs相比,10%HCRL刺激敲除PEPT1的BRECs RIPK2的表达量极显著下调（P＜0.001）。通过细胞免疫荧光染色,与野生型BRECs相比,敲除PEPT1的BRECsp-ERK1/2的红色荧光被减弱。添加10%HCRL刺激BRECs,p-ERK1/2的红色荧光显著加强。然而,10%HCRL刺激敲除PEPT1的BRECsp-ERK1/2的红色荧光被减弱。通过蛋白免疫印迹结果表明,与野生型BRECs相比,敲除PEPT1的BRECs磷酸化p-ERK1/2的蛋白表达量被减少。与添加10%HCRL刺激BRECs相比,10%HCRL刺激敲除PEPT1的BRECs磷酸化p-ERK1/2的蛋白表达量被下调。以上结果证明,PEPT1介导ERK1/2激酶调控BRECs炎症反应。第5章PEPT1介导细菌小肽调控奶牛瘤胃上皮细胞炎症反应本试验旨在研究PEPT1介导细菌二肽MDP和细菌三肽Tri-DAP调控奶牛瘤胃上皮细胞炎症反应。试验分为5个组:野生型BRECs、添加细菌二肽MDP刺激野生型BRECs、添加细菌二肽MDP刺激敲除PEPT1 BRECs、添加细菌三肽Tri-DAP刺激野生型BRECs和细菌三肽Tri-DAP刺激敲除PEPT1 BRECs。结果证明,与对照组相比,细菌二肽MDP和细菌三肽Tri-DAP能够显著促进BRECs IL-6和TNF-α表达量。与MDP和Tri-DAP培养的野生型BRECs相比,MDP和Tri-DAP培养敲除PEPT1 BRECs的IL-6和TNF-α表达量显著下调,同时下调CCL2、CXCL2、CXCL3和CXCL9趋化因子的表达,表明PEPT1能够介导MDP和Tri-DAP调控BRECs炎症反应和趋化因子表达。与对照组相比,MDP和Tri-DAP能显著上调BRECs NOD2和RIPK2的表达量,然而,MDP和Tri-DAP培养敲除PEPT1 BRECs NOD2和RIPK2的表达量被显著下调,同时通过免疫荧光分析,与对照组相比,MDP能够显著加强BRECsp-ERK1/2红色荧光强度。与MDP培养的野生型BRECs相比,MDP培养敲除PEPT1 BRECs p-ERK1/2红色荧光强度被减弱。结果证明,PEPT1能介导细菌小肽调控BRECs NOD2/RIPK2免疫信号通路,进一步诱导下游免疫信号通路p-ERK1/2激酶活性,从而调控促炎症因子和趋化因子的表达。综上所述,本研究证明PEPT1能通过NOD2/RIPK2信号通路调控p-ERK1/2磷酸化水平和NF-κB1转录因子水平进而调控BRECs炎症反应。