目的:百草枯(paraquat,PQ)是世界范围内最广泛使用的高效除草剂之一,具有除草效率高、环境污染小等特点。然而PQ对人、畜有很高的毒性,临床治疗无特效解毒药物,导致中毒死亡率逐年升高。目前,PQ已被数十个国家禁止生产、使用。我国自2014年7月1日起,撤销百草枯水剂登记和生产许可,2016年7月1日停止水剂在国内销售和使用。尽管农药禁用和剂型转换一定程度上降低了中毒发病率,但中毒致死案例仍频繁发生。因此,深入研究PQ中毒机理、研制特效解毒药物仍是毒理学重要课题。肺是PQ中毒的主要靶器官。Ⅰ型肺泡上皮、Ⅱ型肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞膜上存在多胺转运系统,能够使进入血液的PQ迅速在肺内浓集。最终,PQ在肺组织内的浓度可达血浆浓度数十倍。急性肺泡炎和快速进展的不可逆性肺纤维化,是PQ中毒的特征性病理表现。尤其,中毒后期肺纤维化及其导致的呼吸衰竭已经成为PQ中毒的重要死亡原因。目前,关于PQ中毒导致肺纤维化的起源、形成的详细机制仍不明确,国内外相关的研究十分匮乏。最近,越来越多的研究发现,PQ能够通过诱导自噬损害发挥其毒性作用,可能存在的机制有:(1)PQ导致经典mTOR活化,导致自噬水平抑制;(2)受损线粒体清除障碍,损害自噬流;(3)溶酶体水解酶活性的抑制。自噬(autophagy)是一种通过溶酶体降解细胞内有缺陷或过量的大分子蛋白质和细胞器,从而维持细胞内稳态的重要保护性机制。自噬过程是动态变化的,自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程称为自噬流。自噬异常参与多系统疾病发生发展,如癌症、神经退行性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病等。越来越多的研究发现自噬不足或自噬流阻滞参与了肺纤维化相关疾病的发生,包括特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)、矽肺等。我们使用Masson染色和天狼星红(纤维化动态观察)、免疫组化、免疫荧光、western blot等手段检测PQ中毒的人体材料和实验动物肺组织中自噬相关蛋白Beclin 1、微管相关蛋白轻链3(LC3)、SQSTM1/p62和溶酶体相关膜蛋白-2(LAMP-2)的表达变化,并在IMR-90细胞中使用自噬药物调控、沉默自噬基因Beclin 1等手段,探讨PQ中毒导致的自噬变化及其在纤维化中作用和相关分子机制。研究方法:PQ中毒人体材料检测:收集筛选出中国医科大学司法鉴定中心2008年7月至2018年3月期间8例PQ中毒死亡案件肺组织的样本及相关案情数据资料,同时收集8例相对正常的肺组织标本作为对照案例。使用HE染色、Masson、天狼星红染色和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫组织化学方法检测中毒案例和对照案例肺组织的病理学变化和纤维化改变。根据显微镜下肺纤维化染色结果,我们将中毒案例分为中毒纤维化组和中毒非纤维化组。我们使用免疫组织化学染色方法检测两组标本及对照案例肺组织中的自噬相关蛋白Beclin 1、LC3和p62,观察自噬相关蛋白在肺组织中的表达、分布及其与肺纤维化的相关性。最后,我们免疫荧光染色检测两组标本及对照案例肺组织中LC3表达变化,间接观察自噬小体形成。动物模型:健康8~10周龄清洁级C57BL/6小鼠120只,雄性,重量为22~26g。小鼠适应性喂养一周,环境温度20℃,12h昼夜节律,自由进食、饮水。一周后,将其随机分为2组:对照组(Cont,60只)、实验组(PQ,60只),其中实验组按照PQ染毒后暴露时间分成6个亚组(1d组、3d组、7d组、14d组、21d组、28d组),对照组分为6个对应时间组,每组10只小鼠。实验结束后处死小鼠,提取肺组织,左肺组织制备石蜡切片,右肺上叶用于检测羟脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)水平检测,其它肺组织用于提取蛋白。应用HE染色、Masson、天狼星红染色和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达观测肺纤维化病变过程。检测肺组织中羟脯氨酸含量变化。应用免疫组化和Western blot检测小鼠肺组织中自噬相关蛋白Beclin 1、LC3、p62和LAMP-2表达变化。细胞实验:选用人胚肺成纤维细胞(IMR-90),培养基中添加无菌PBS溶解的PQ溶液至终浓度为100μM处理细胞24h。药物预处理组于PQ给药前2h加入自噬诱导剂RAPA(1μM)或加入自噬流阻滞剂CQ(25μM)。应用RNAi沉默Beclin 1基因。使用MTS试剂盒测定细胞活力。应用免疫荧光检测LC3荧光斑点数量变化。应用Western blot检测细胞内Beclin 1、LC3、p62、α-SMA和LAMP-2的表达变化。结果:人体样本HE染色结果显示,对照肺组织表现出相对正常的组织结构,未见纤维化改变;中毒案例肺组织主要病理表现有肺水肿、肺出血、急性肺泡炎等改变;其中部分案例可见肺间质及肺泡腔成纤维细胞增生、胶原蛋白沉积。Masson、天狼星红染色和α-SMA免疫组化染色结果显示,部分中毒案例肺组织呈现明显纤维化改变。免疫组化染色显示,自噬相关蛋白Beclin 1、LC3和p62在对照肺组织和中毒非纤维化肺组织中未见表达或仅有微量表达,而在中毒纤维化组肺组织中表达均明显升高,并与肺纤维化存在明显相关性。其中,自噬降解标志物p62表达升高提示PQ中毒纤维化肺组织中自噬降解受阻。免疫荧光结果显示,与对照案例比较,中毒纤维化组肺组织LC3荧光斑点明显增加,提示自小体在细胞内堆积。上述结果提示,PQ中毒肺组织细胞中可能存在自噬流障碍以及自噬小体堆积现象。PQ染毒小鼠体重呈现先下降后上升的趋势,但整体体重增长较对照组迟缓。PQ各时间组小鼠肺组织主要病理表现为大致经过肺淤血水肿、急性肺泡炎、肺纤维化。Masson和天狼星红染色显示,PQ染毒早期(1d、3d)胶原纤维少量分布,继而逐渐增多,除1d、3d组外,其它各时间组纤维化评分(Masson)均明显高于对照组。HYP含量随时间推移逐渐升高,与Cont相比,至染毒第7d上升明显(P<0.05),第14d继续升高,21d显著升高,达到峰值(P<0.01),第28d略有下降,但仍显著高于对照组(P<0.01),HYP含量变化与形态学观察基本一致。PQ组小鼠各不同时间点肺组织Beclin 1、LC3-Ⅱ、p62和α-SMA表达升高,除1d组外,其它组与同期对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),多组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。Beclin 1、LC3-Ⅱ和p62呈现平行表达,随染毒时间推移逐渐升高,于21d出现峰值。α-SMA表达随染毒时间持续上升,至21d达峰值,28d稍有下降,但仍高于同期对照组。同期对照组相比,PQ组各时间组(1d除外)LAMP-2与蛋白表达明显下降,差别有显著统计学意义。我们发现PQ染毒成纤维细胞中自噬相关蛋白Beclin 1、LC3-Ⅱ和p62表达升高,LC3荧光斑点数量明显增多,提示PQ染毒诱导了成纤维细胞自噬流阻滞,PQ染毒同时提高了α-SMA表达水平、降低了LAMP-2表达水平,提示PQ染毒促进了成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,并导致溶酶体功能下降;使用RAPA提升基础自噬水平,能够减弱PQ诱导的自噬流阻滞,同时提高改善PQ中毒导致的溶酶体损害,并减少肌成纤维细胞的分化。应用自噬抑制剂CQ或沉默自噬基因Beclin 1抑制基础自噬水平,表现出与RAPA相反作用。这些发现进一步确证了PQ人体材料和动物材料肺组织中自噬流阻滞的现象,并发现PQ中毒可能通过损害溶酶体功能导致自噬流阻滞,进而促进肌成纤维细胞分化和纤维化的发生。结论与展望:(1)PQ中毒导致肺组织细胞自噬流阻滞。(2)PQ中毒可能通过损害溶酶体功能导致自噬流阻滞。(3)PQ中毒诱导的自噬流阻滞通过促进肌成细胞分化参与了肺纤维化的形成。(4)自噬激活可能成为PQ中毒诱导的肺纤维的治疗靶点。(5)PQ中毒后不同存活时间所引起的肺纤维化的程度可能作为中毒时间的推断依据。