牵牛子(Morning Glory Seed)为旋花科植物裂叶牵牛Pharbitis nil (L.) Choisy或圆叶牵牛Pharbitis purpurea (L.)Voigt的干燥成熟种子,收载于历版《中国药典》,在我国资源丰富,为利水渗湿要药。然而,古代文献记载和现代临床应用都表明牵牛子对人体具有肾毒性作用,毒性一直制约着其临床应用。本研究基于代谢组学方法并结合血清生化与组织病理学手段,对该中药所致肾损伤而引起的内源性物质变化进行了较为系统的研究,对可能的致病机理进行了初步解释,为临床合理用药和中药致肾损伤的防治提供了依据。1.牵牛子致大鼠肾损伤模型的建立首先通过血清生化和组织病理学方法对牵牛子提取物的肾毒性进行了考察,从而建立了牵牛子致肾损伤模型。以常见肾毒性中药关木通为阳性对照药并以血清肌酐,尿素氮和组织病理切片为判断标准,用牵牛子的水提取物和95%乙醇提取物分别对大鼠进行了连续14d的亚急毒性剂量(15g/kg/day)灌胃给药,结果表明牵牛子肾毒性物质主要存在于95%乙醇提取物中。然后用牵牛子95%乙醇提取物以亚慢毒性剂量(3g/kg/gay)对大鼠进行了为期10周的灌胃给药,结果显示亚急毒性剂量和亚慢毒性剂量均能导致大鼠肾损伤,该模型的建立为后续代谢组学研究奠定了基础。2.牵牛子肾毒性代谢组学研究采用基于UPLC-MS的代谢组学方法对亚急毒性剂量和亚慢毒性剂量给药后大鼠的血清、尿液和肾组织代谢物轮廓的变化进行了研究,共发现磷脂酰胆碱类、溶血卵磷脂类、氨基酸类和儿茶酚胺类等共30个代谢产物浓度的变化与牵牛子诱导的肾损伤有关。血清代谢组学研究表明,在亚急毒性剂量下,模型组大鼠血清中肌酐和溶血卵磷脂类物质浓度明显升高,而苯丙氨酸浓度下降。在亚慢毒性剂量下,模型组大鼠在不同时间点的血清代谢物轮廓变化有所不同。给药后第2周,浓度发生变化的主要是溶血卵磷脂和氨基酸类物质,而第6周则是磷脂酰胆碱类物质浓度显著升高,给药后第10周出现了模型组血清肌酐、高半胱氨酸、腺苷和溶血卵磷脂浓度明显高于对照组的现象。尿液代谢组学结果显示,在亚急毒性剂量下,模型组大鼠尿液中氨基酸、叶酸和胆酸浓度明显高于对照组。在亚慢毒性剂量下,给药第2周模型组浓度发生变化的内源性物质主要有马尿酸、犬尿烯酸、苯乙酰甘氨酸和肌酐；给药后第6周除苯乙酰甘氨酸和肌酐之外,模型组牛磺酸、高半胱氨酸、胆酸和去氧胆酸浓度明显升高；而给药后第10周,在第6周原有标记物变化的基础上,肾上腺素、腺苷和次黄嘌呤在模型组的浓度明显高于对照组。另外,采用乙腈和二氯甲烷两种溶剂对大鼠给药后的。肾组织代谢物进行了提取,经分析发现,在亚急毒性和亚慢毒性剂量下,模型组肾组织主要表现为溶血卵磷脂,鞘胺醇和磷脂类代谢物轮廓的变化。3.牵牛子肾毒性部位研究以建立的毒理学模型为指导,本研究对牵牛子95%乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物进行了肾毒性考察。结果表明,正丁醇组大鼠的尿素氮和肌酐值均显著高于对照组、石油醚组和乙酸乙酯组,且病理切片也显示正丁醇组大鼠肾组织出现明显病变。应用血清和尿液代谢组学方法,本研究尝试对不同萃取物组进行分型。血清代谢组学研究结果表明,相对于乙酸乙酯组和石油醚组,正丁醇组在主成分1方向与对照组的距离更大,这与毒理学研究结果相符；而尿液代谢组学研究结果则显示,在主成分1方向上,正丁醇组与乙酸乙酯组均较石油醚组与对照组之间的距离更大,与毒理学研究中乙酸乙酯组肾小球的轻度病变和肌酐的上升相对应。鉴于正丁醇组在毒理学和代谢组学两方面研究中所提供的有力论据,可以确认牵牛子的’肾毒性部位为95%乙醇提取物的正丁醇萃取物,这为该药的肾毒性物质基础和致毒机理的深入研究奠定了基础。