[背景] 器官移植的成功往往依赖于毒性、非特异性免疫抑制剂的应用。而这类药物常常导致机会感染、恶性肿瘤等并发症的发生，根本的解决出路之一就是寻找诱导抗原特异性耐受或实现抗原特异性抑制的治疗方法和策略。器官移植物的基因治疗和基因修饰的耐受性树突状细胞（dendritic cell，DC）诱导免疫耐受的相关进展为临床器官移植提供了极具潜力的治疗方法。尝试应用免疫抑制性调节分子基因修饰移植器官进行局部免疫调控或基因修饰树突状细胞诱导免疫耐受已成为移植研究领域的热点。 树突状细胞（dendritic cells，DC）作为一类具有最强抗原提呈功能的细胞群体，在识别和递呈抗原启动免疫应答、诱导移植排斥中起重要的作用。近年来的研究表明，DC是一类异质性细胞群体，具有不同的亚群和不同的功能状态，不但在增强免疫反应上具有特别重要的作用，也具有诱导特异性免疫耐受的作用。DC提呈抗原方式的免疫性或耐受性决定了DC既可以启动免疫反应也可以诱导中枢性或外周性免疫耐受。目前已有研究表明通过免疫抑制分子的基因如vIL-10、TGF-β、和CTLA4-Ig等基因修饰可能会使得DC潜在的耐受原性得以放大和增强，因此，DC在诱导免疫耐受中具有相当重要的作用及潜在的应用价值。 Fas／FasL是介导细胞凋亡的重要的免疫活性分子，它不仅参与了胸腺选择、免疫豁免（immune-privilege）协调平衡免疫反应等许多重要的生理过程，而且与一些肿瘤的发生发展、器官移植耐受和排斥反应、自身免疫性疾病的产生以及感染、炎症等许多病理生理反应密切相关。研究发现FasL在睾丸、Sterotil细胞Fas Ligand基因修饰的骨做树突状细胞在同种移植中的作用第二军医大学博士论文和眼前房等免疫特赦器官上有较高表达，其免疫特赦的机制就是FasL与Fas结合通过Fas邝asL途径诱导Fas+的淋巴细胞凋亡从而免遭排斥。因此，如果提高移植物FasL的表达，则有可能会导致排斥反应的主要效应细胞T淋巴细胞的凋亡，从而达到抗移植排斥作用。Lau创造性将异源胰岛细胞和人工构建的由FasL基因转染的同源成肌细胞混合植于小鼠肾包囊中，其存活时间较单纯胰岛细胞移植明显延长，证实FasL基因治疗能给移植的胰岛细胞提供特异性免疫保护作用。Zhang等用表达FasL的H一Zb APC治疗H-ZK小鼠，成功地诱导同种异基因间的抗原特异性T细胞的低反应性。既往研究表明，靶组织表达FasL能诱导浸润的淋巴细胞凋亡，从而保护靶组织免受攻击。鉴于DC在移植免疫中的重要作用，我们可以推测，通过FasL基因修饰的DC进一步认识FaS/F asL在同种异体移植中的凋亡作用和机制，将有可能寻求一种移植物免疫耐受的途径，这种途径能通过凋亡机制特异性地清除移植物中同种异体抗原激活的淋巴细胞，使移植物免遭排斥。 本研究利用小鼠血管化的心脏异位移植模型和基因转移技术，通过FasL基因的腺病毒载体转染·DC，分析FasL基因修饰对DC及同种效应T淋巴细胞功能、活性的影响，观察其在小鼠心脏移植排斥反应中的效果，并对其发生的机制进行探讨第一部分AdFasL基因修饰对Dc、T淋巴细胞功能的影响 采用rmGM一CSF与去除淋巴细胞的骨髓细胞体外培养的方法，可获得纯度较高的骨髓来源的DC。观察DC发育过程中的形态变化，发现培养第三天即可见细胞成簇生长，可见到少量细胞呈现出粗短的枝状突起，培养完成时细胞密集成团，枝状突起仍不多见。经IO0ng/ml LPS刺激18小时后，细胞表面伸出很多突起，宛如蟹足。第7天用光镜观察及流式细胞术（FACs）鉴定都肯定所培养的细胞具有成熟DC的性质一细胞表面较高表达MHCn类分子及共刺激分子（eD40、CDso、CDs6等）。 腺病毒是一种高效的基因转移载体，实验中，我们设定不同的Mol值对其进行转染。培养至第7天的DC更换无血清RPMll640培养基，按MOI二1:10，1:40，1:80，1:120分别加入腺病毒基因载体。在37℃、5%COZ孵箱中培养2小时Fas Ligand墓因修饰的骨做树突状细胞在同种移植中的作用第二军医大学博士论文后再加入小牛血清和GM一CSF并使之达到规定浓度。继续在37℃、5%C伍孵箱中培养18一20小时后收获细胞。为了解AdFasL对DC的转染效率以及转染后基因的表达情况，我们进行了FAcs分析发现，AdFasL按MOI二1:80，在转染20小时后具有较高的FasL表达。因此我们认为1:80已经达到或者至少接近了最适Mol值，在以后的实验中，均采用1:80为默认的重复转染率。 为明确AdFasL基因转染对DC成熟表型及抗原递呈功能的影响，我们对基因修饰的DC进行了队CS分析。发现FasL基因转染并未使细胞特征发生大的变化。转染后DC表面分子CD80（B7一l）CD86（B7·2）和CD40等表达没有明显的改变，同时用ELISA检测了IL一2水平，结果显示AdFasL基因的转染对DC的抗原递呈功能没有明显影响，这说明FasL基因转染DC这种应用方式是可行的。有报道认为DC转染FasL基因后可能会导致DC自身的凋亡，我们在实验中用FACS分析了转染后DC的凋亡情况，和对照相比并未发现明显DC自身的凋亡。 实验中，我们将C57BL/6小鼠FasL一DC与异基因BALB/C小鼠脾脏T淋巴细胞共培养48小时后，通过流式细?