论文部分内容阅读
第一部分心脏移植急性排斥反应99mTc标记CD4单抗显像研究目的:开发新型核素分子探针99mTc-HYNIC-m AbCD4,特异性靶向CD4+T淋巴细胞,实现心脏移植急性排斥反应（acute rejection,AR）的早期诊断。方法:（1）制备靶向探针99mTc-HYNIC-m AbCD4及对照探针99mTc-HYNIC-Ig G,测定其放射性标记率、放射化学纯度和体外稳定性;（2）提取大鼠淋巴结CD4+T淋巴细胞作为阳性细胞,以大鼠肺泡巨噬细胞NR8383作为阴性细胞。利用蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测两种细胞表面CD4分子表达水平。流式细胞术和免疫荧光染色检测anti-CD4抗体与CD4+T淋巴细胞的结合亲和力;（3）通过细胞结合实验考察探针与CD4+T淋巴细胞结合的亲和力和特异性;（4）构建大鼠心脏移植模型,术后5天经尾静脉注射99mTc-HYNIC-m AbCD4（11.1~37 MBq/只,n=5）,通过单光子发射计算机断层显像（single-photon emission computed tomography,SPECT）和生物分布研究,验证探针对发生AR移植心的靶向特异性;（5）组织学检测各组移植心的淋巴细胞浸润情况及CD4表达水平。结果:（1）成功构建99mTc-HYNIC-m AbCD4和99mTc-HYNIC-Ig G,标记率分别为73.31±0.95%、63.10±1.89%,比活度分别为8.14±0.11 MBq/μg、7.01±0.21 MBq/μg（n=5）;经PD-10纯化后,放化纯均>95%;两种探针在磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）和胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）中孵育12 h,放化纯仍维持在85%以上,表明探针具有较高的体外稳定性;（2）Western Blot结果表明CD4+T淋巴细胞的CD4表达量明显高于巨噬细胞。流式细胞术和免疫荧光显示实验组荧光强度显著高于对照组,且可被成功阻断;（3）体外细胞结合实验中,加入99mTc-HYNIC-m Ab CD4的CD4+T细胞实验组细胞摄取率随孵育时间延长而逐渐增加,6小时达到最高;且可被游离的非标记抗体成功阻断;实验组各时间点的细胞摄取率均明显高于巨噬细胞对照组和Ig G探针对照组;（4）成功构建了大鼠心脏移植模型,SPECT显像和生物分布研究结果显示异体移植组大鼠的移植心较异体移植治疗组、同系移植组的移植心有更高的放射性摄取,同时与注射同型对照探针99mTc-HYNIC-Ig G的异体移植组大鼠的移植心相比也具有明显的统计学差异,证明探针的体内靶向特异性强;（5）离体组织学检测显示异体移植鼠的移植心有大量CD4+T淋巴细胞浸润和心肌组织破坏。结论:成功制备新型核素分子探针99mTc标记anti-CD4单抗,具有较高的标记率和放化纯及良好的体外稳定性。该探针能够特异性靶向移植心处的CD4+T淋巴细胞,实现急性排斥反应的早期诊断。结果表明,99mTc-HYNIC-m AbCD4核素分子显像有望成为心脏移植急性排斥反应无创诊断的新方法。第二部分心脏移植急性排斥反应68Ga标记LLP2A多肽显像研究目的:迟现抗原-4（very late antigen 4,VLA-4）在淋巴细胞分化和转运中发挥重要作用,是分子成像的潜在靶点。本研究拟构建一种VLA-4靶向核素分子探针68Ga-NODAGA-LLP2A,实现心脏移植急性排斥反应的早期诊断。方法:（1）利用螯合剂NODAGA-NHS修饰VLA-4靶向多肽LLP2A,随后放射性标记68Ga制备核素分子探针68Ga-NODAGA-LLP2A。通过放射分析型高效液相色谱（analytical radio-high performance liquid chromatography,radio-HPLC）测定探针的放射性标记率、放射化学纯度和体内外稳定性;（2）提取大鼠脾脏单个核细胞作为阳性细胞,选取心肌细胞H9C2作为对照细胞。利用蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测两种细胞表面VLA-4分子表达水平。通过细胞结合实验考察探针靶向VLA-4的特异性;（3）构建大鼠腹腔异位心脏移植模型,包括异体移植组、异体移植治疗组、同系移植组。移植后5天经尾静脉注射68Ga-NODAGA-LLP2A（5.5~7.4 MBq/只,n=5）,通过正电子计算机断层显像（positron emission tomography,PET）、放射自显影和生物分布研究验证探针的体内靶向特异性。结果:（1）成功制备了靶向探针68Ga-NODAGA-LLP2A,标记率大于95%,比活度为37~74 MBq/nmol（n=5）,具有良好的体内外稳定性;（2）Western Blot结果表明单个核细胞的VLA-4表达量明显高于心肌细胞。细胞结合实验显示,单个核细胞对探针的细胞摄取率明显高于心肌细胞;（3）PET/CT显像、放射自显影和生物分布结果显示,探针在异体移植鼠的移植心处有较高的放射性聚集,而在异体移植阻断组和治疗组中放射性聚集较低,同系移植组大鼠的移植心处及正常鼠的腹部未见明显放射性摄取。结论:68Ga-NODAGA-LLP2A具有良好的VLA-4靶向性,可在急性排斥反应发生时特异性积聚于移植心处,有望成为心脏移植急性排斥反应诊断的新型PET显像剂。