灰飞虱Laodelphax striatells(Fallen)是水稻上重要的刺吸式害虫,属半翅目Hemiptera,飞虱科Delphacide。灰飞虱不仅为害水稻、小麦、玉米和高粱等多种谷类作物,还取食禾本科杂草;不仅通过刺吸茎秆影响水稻产量,还传播多种植物病毒病。长期大量使用化学农药来防治灰飞虱,导致了灰飞虱抗药性的产生。近年来,灰飞虱具有发生面积及范围扩大、暴发率增加和为害程度加重等显著特点。当今,化学防治仍是防治灰飞虱的主要对策,但由于灰飞虱抗药性问题日益突出,化学防治面临着许多困难。因此,必须加强对灰飞虱的抗性治理,延缓其抗性的进一步发展,提高现有农药品种的防治效果。而明确杀虫剂的抗性机制是害虫抗性治理的前提。本文通过室内筛选的灰飞虱抗乙虫腈品系和相同遗传背景的敏感品系,克隆乙虫腈靶标基因和ABC转运蛋白基因,并对抗、感试虫的靶标基因序列进行了比对分析和可变剪接发生频率与突变频率的检测,由此就灰飞虱对乙虫腈的靶标抗性机理进行了研究,以便为更好地治理灰飞虱抗性提供科学依据。一、灰飞虱抗乙虫腈品系的筛选与毒力测定为揭示室内筛选条件下灰飞虱对乙虫腈的抗性发展动态以及乙虫腈与其他种类药剂的交互抗性,本研究以经室内抗性筛选8代后,停止筛选一段时间后的抗性种群为起始种群,通过室内进一步连续用乙虫腈进行6代抗性筛选,获得了对乙虫腈抗性水平极高的抗性品系,同时通过室内不接触药剂繁育,获得了相同遗传背景的敏感品系。随后利用抗性品系和敏感品系试虫,测定了吡虫啉、毒死蜱和溴氰菊酯这三种药剂对抗、感品系试虫的毒力。结果显示:先前室内筛选8代使乙虫腈抗性倍数从田间初始种群的107倍发展到180倍,停止用药后至本研究开始时(GO代)抗性倍数下降至71倍,重新筛选至G2代的抗性倍数为136倍,G4代的为325倍,G6代的试虫抗性已经达到极高抗水平,200ng/头的药剂剂量死亡率仅为37.5%,抗性倍数大于725倍,抗性增长比率大于10倍。这说明灰飞虱在田间产生抗性后,如果停止用药,待抗性下降后恢复用药,其抗药性发展会更为迅速。测定乙虫腈抗性品系对吡虫啉、毒死蜱和溴氰菊酯的抗性倍数仅分别为4.2倍、4.4倍和4.3倍,表明乙虫腈与吡虫啉、毒死蜱和溴氰菊酯这三种药剂之间无明显的交互抗性。二、灰飞虱抗乙虫腈相关基因的克隆在灰飞虱抗乙虫腈的研究中,代谢酶的作用已有较深入的研究,但较为重要的靶标抗性和转运排泄尚不清楚。本研究利用灰飞虱转录组数据对ABC转运蛋白基因片段进行了搜索和克隆验证,去冗余后进行RACE末端克隆,最终获得6条具有全长序列的ABC转运蛋白基因。同时参照已有报道对靶标GABA受体基因进行了克隆,不仅成功克隆到了已报道的RDL1全长基因,还发现了尚未见报道的灰飞虱RDL2基因。RDL1基因的全长为1830 bp,其中,开放阅读框长度为1464bp,编码487个氨基酸;5’非编码区长度为55bp,3’非编码区长度为311 bp。RDL2基因全长为2129bp,开放阅读框长度为1452 bp,编码483个氨基酸;5’非编码区和3’非编码区长度分别为55 bp和622 bp。RDL1与RDL2的氨基酸序列相似度为91%,差异在第三跨膜区之后,尤其是3’非编码区序列差异较大。三、灰飞虱GABA受体RDL基因的变异分析本研究在克隆获得2个灰飞虱RDL基因的基础上,进一步利用敏感品系和抗性品系试虫,克隆并比较了乙虫腈抗、感灰飞虱个体内不同RDL基因的序列差异,以期寻找抗药性突变。结果发现灰飞虱GABA受体两个RDL基因均存在类似的可变剪接,包括3号外显子的3a、3b和3c三种可变剪接类型,6号外显子的6a和6b两种,以及第三跨膜区和第四跨膜区之间的两种可变剪接类型。检测不同剪接类型在抗、感品系中的分布发现,除个别剪接类型没有检测到外,大部分剪接类型在抗、感品系中均有分布,虽然分布频率稍有差异,但整体趋势一致,故尚不能确定抗药性相关的剪接类型。另外,通过对抗、感品系2个基因序列的对比分析,发现2个基因不仅有此前在许多昆虫中报道与抗性有关的A2’N突变,还发现了 A337V和G376缺失,并且两个突变和一个缺失是连锁的。统计显示RDL1在抗性品系中的突变频率为46%,在敏感品系中的突变的频率为3%;而RDL2在抗性品系中的突变的频率为72%,在敏感品系中的突变频率为11%。由此可以看出,两个基因在抗性品系中的突变频率均明显高于敏感品系,而且RDL2在抗、感品系中的突变频率均高于RDL1。由此认为检测到的连锁突变与灰飞虱对乙虫腈的抗性有关,且2个基因均发挥了一定作用。鉴于2个基因的大部分序列一致,进一步研究尚需弄清2个基因的起源关系,并提供突变产生乙虫腈抗性的直接证据。