几丁质是昆虫外骨骼的主要组成成分,具有支撑身体,阻碍捕食者的捕食,防御病原体侵入等功能,表皮物质中大约40%的成分是几丁质。几丁质也存在于部分昆虫前肠和后肠的肠衬、口器和唾液腺中,同时中肠的围食膜也主要是由几丁质和蛋白构成。几丁质的合成和降解分别需要几丁质合成酶和几丁质酶,这两种酶与昆虫的生长发育具有密切关系。根据几丁质酶基因结构的最新研究表明,几丁质酶可以分为8个Group,8个Group除了结构不同外,每个Group的功能也不相同。为了研究二化螟体内的几丁质酶的结构和功能,本文以鳞翅目螟蛾科昆虫二化螟(Chilo suppresalis)为研究对象,利用RACE 术克隆了 4个几丁质酶基因cDNA全长并对其基因序列和表达量进行分析,同时研究结果表明不同的几丁质酶在不同龄期高表达,我们猜测与几丁质的含量和成分有关,因此我们对几丁质在二化螟体内的含量进行了测定。1)二化螟几丁质酶基因的全长克隆从二化螟转录组数据中获得4个几丁质酶相关蛋白的基因片段,即CsCht1、CsCht2、CsCht3和CsCht4。经序列验证后,利用RACE技术,成功获得这4个基因的cDNA序列全长,对4个基因蛋白序列的分子量、等电点预测发现,CsCht1、CsCht2和CsCht3的分子量在40-85 kD之间,PI值在5-7之间;而CsCht4的分子量为37.11 kD,其PI值达到9.25,同时发现4个几丁质酶蛋白序列均含有α螺旋、延伸链、β折叠和无规则卷曲等二级结构。2)二化螟几丁质酶基因家族的分析对二化螟12个几丁质酶基因序列的基因结构、蛋白结构域及系统发育进行分析。结果表明,12个几丁质酶序列的外显子和内含子的数量不相同,所含外显子和内含子的长度也不相同。CsCht5和家蚕、赤拟谷盗、黑腹果蝇和意大利蜜蜂的Cht5在基因结构上也不相同,表明Cht5基因在序列上具有保守性,而基因结构却发生了改变;蛋白结构域方面,12个几丁质酶序列都属于糖基水解酶18家族(GH18),CsCht1、CsCht3、CsCht5和CsCht7都含有保守结构域ChtBD2,CsCht10含有保守结构域ChtBD3;通过构建几丁质酶系统进化树,发现CsCht5和CsCht7两个基因属于GroupⅠ,CsCht3 和 CsCht9 两个基因属于 Group Ⅱ,CsCht1 和CsCht6属于 Group Ⅲ,CsCht2、CsCht4、CsCht8、CsCht11和CsCht12和属于 Group Ⅳ;Group Ⅵ 含有 CsCht10 基因,而Groups Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ中尚未发现二化螟的几丁质酶基因。3)二化螟几丁质酶基因的组织表达量分析利用qRT-PCR分析了 4个几丁质酶基因在不同组织内的表达量情况。结果表明,CsCht1和CsCht3在表皮的表达量较高,头部次之,而在脂肪体、中肠和马氏管的表达量较低;而CsCht2和CsCht4则在中肠的表达量较高,而在头部、脂肪体、中肠和马氏管的表达量都较低。分析认为CsCht3基因属于Group Ⅱ,CsCht1属于Group Ⅲ,Group Ⅱ和Ⅲ都在昆虫蜕皮时期具有重要作用;Group Ⅳ的几丁质酶只在昆虫幼虫和成虫期表达,且在幼虫肠道组织中含量比较高,因此属于Group Ⅳ的几丁质酶CsCht2、CsCht4可能调控围食膜几丁质的含量。4)二化螟不同发育阶段几丁质含量的测定几丁质是昆虫表皮的重要组成成分,利用灰色链霉菌产生的几丁质酶测定二化螟在幼虫发育、化蛹、成虫羽化等发育阶段几丁质的含量,结果表明:几丁质在各个龄期内含量总的趋势是龄期第一天和最后一天含量比较低,3龄时期第二天几丁质含量最高;4龄时期第三天几丁质含量最高;5龄时期第四天几丁质含量最高;6龄时期第三天至第五天几丁质含量较高;蛹期第二天至第六天几丁质含量都较高;预蛹和成虫期体内几丁质含量处于较低水平。对二化螟几丁质酶基因及几丁质的研究,将为开发环境友好型生物农药进行害虫防治提供重要理论基础。