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鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国高发恶性肿瘤之一,发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。由于缺乏典型的早期临床症状,许多患者在就诊时已发生淋巴结转移,并且远处转移是鼻咽癌主要死亡原因之一。要减少鼻咽癌的死亡率和改善预后,最有效的措施就是早发现早治疗。SPRY4是Sprouty蛋白家族成员之一,广泛存在于人体组织中。多项研究发现,SPRY4在不同肿瘤中发挥不同的作用,既可以作为肿瘤抑制基因,也可以是致癌基因。在睾丸生殖细胞瘤中,表达上调的SPRY4起着致癌因子的作用;在非小细胞肺癌、乳腺癌和食管癌中,表达下调的SPRY4则起着肿瘤抑制因子的作用。因此,SPRY4在肿瘤中的差异表达可能有助于癌症的诊断和靶向治疗。目的研究Sprouty蛋白家族中的成员之一SPRY4在不同鼻咽癌细胞中的表达差异及其在鼻咽癌细胞上皮-间质转化和转移中的作用,并探讨可能的作用机制。方法1.利用实时荧光定量PCR(Real Time-PCR,RT-PCR)和蛋白印迹Western blot检测永生化鼻咽上皮细胞NP69和不同鼻咽癌细胞株中SPRY4的mRNA水平及蛋白表达情况。利用慢病毒载体系统获得敲减SPRY4的SUNE-1细胞株和过表达SPRY4的CNE-2细胞株,并用实时荧光定量PCR和蛋白印迹Western blot检测其敲减/过表达效果。2.通过CCK-8实验和实时无标记细胞检测技术(RTCA)检测SPRY4改变对于鼻咽癌细胞增殖能力的影响;通过划痕实验、迁移实验及侵袭实验检测SPRY4改变对于鼻咽癌细胞转移能力的影响;Western blot检测转移相关蛋白MMP2、MMP9的改变。3.通过相差显微镜观察上调及下调SPRY4对于鼻咽癌细胞形态的影响,Western blot检测上皮-间质转化相关标志蛋白(N-cadherin、Vimentin、E-cadherin)的改变。4.通过Western blot检测PI3K/AKT信号通路蛋白的改变。5.通过生物数据库分析SPRY4可能的上游转录因子,并利用Western blot检测和CHIP-Seq实验对其进行验证。6.通过Western blot检测自噬相关通路蛋白的改变。结果1.RT-PCR和Western blot检测显示,与永生化鼻咽上皮细胞株NP69对比,SPRY4在四种鼻咽癌细胞株SUNE-1、CNE-2、6-10B和C666-1呈高表达;与相应的空载细胞株对比,敲减SPRY4的SUNE-1细胞株和过表达SPRY4的CNE-2细胞株中SPRY4的mRNA和蛋白质分别呈低表达和高表达。2.CCK-8实验和实时无标记细胞检测技术(RTCA)检测结果显示:SPRY4的改变不影响鼻咽癌细胞的增殖能力。转移相关功能学实验及转移相关蛋白结果显示:下调SUNE-1细胞株中SPRY4表达,SUNE-1细胞的划痕愈合能力、迁移和侵袭能力均显著下降;而过表达SPRY4则促进CNE-2细胞株的划痕愈合、迁移和侵袭。Western blot检测显示:下调SPRY4表达,MMP2、MMP9表达下调,反之,MMP2、MMP9表达上调。3.EMT相关实验和EMT相关蛋白检测显示:下调SPRY4后,SUNE-1细胞株发生间质-上皮转化(Mesenchymal-epithelial transition,MET);而过表达SPRY4诱导CNE-2细胞发生上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)。Western blot检测显示:沉默SPRY4表达,N-cadherin、Vimentin蛋白表达下降,E-cadherin蛋白表达上调;反之,N-cadherin、Vimentin、E-cadherin呈相反改变。4.Western blot检测显示:沉默SPRY4表达,磷酸化蛋白p-PI3K和p-AKT下调;过表达SPRY4,PI3K、AKT磷酸化蛋白呈相反变化;并且PI3K总蛋白和AKT总蛋白均未有所变化。5.根据生物信息库分析猜测:TFAP2A可能是SPRY4基因的上游转录因子,RT-PCR、Western blot检测和CHIP-Seq实验结果显示:下调TFAP2A表达,SPRY4 mRNA及蛋白表达水平未改变;TFAP2A未与SPRY4 DNA相互结合。6.自噬相关通路蛋白结果显示;SPRY4可能通过抑制自噬从而促进鼻咽癌细胞的侵袭和转移。结论SPRY4促进鼻咽癌细胞的上皮-间质转化和转移。推测SPRY4可能通过激活PI3K/AKT信号通路诱导鼻咽癌细胞发生上皮间质转化,从而促进鼻咽癌细胞的侵袭和转移能力;SPRY4可能通过抑制自噬从而促进鼻咽癌细胞的侵袭和转移能力;TFAP2A转录因子不是影响SPRY4在鼻咽癌中过表达的直接因素。