【摘 要】
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黑素皮质素受体4（MC4R）属于G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors,GPCR）超家族的成员之一。研究证实,MC4R在调节食欲和体重平衡中发挥重要作用。目前在人和小鼠上研究MC4R基因较多,近年来也有禽类及猪的研究报道,但在山羊中的研究较少。为了深入研究山羊MC4R（g MC4R）基因在信号转导方面的功能机制,本实验将三个品种90头山羊的血液DNA混池测序,发现了
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黑素皮质素受体4（MC4R）属于G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors,GPCR）超家族的成员之一。研究证实,MC4R在调节食欲和体重平衡中发挥重要作用。目前在人和小鼠上研究MC4R基因较多,近年来也有禽类及猪的研究报道,但在山羊中的研究较少。为了深入研究山羊MC4R（g MC4R）基因在信号转导方面的功能机制,本实验将三个品种90头山羊的血液DNA混池测序,发现了9个自然突变位点,分别是:p.T9M、p.A36D、p.A112T、p.N120S、p.I168V、p.I204M、p.Y302*、p.F313S和p.I316L。针对这9个突变位点,构建山羊MC4R突变体的真核表达载体,利用报告基因检测法,检测g MC4R野生及突变质粒在细胞内的第二信使磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate,c AMP）水平;使用Western Blot测定在配体作用下g MC4R野生及突变质粒的细胞外调节蛋白激酶1/2（Extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2）磷酸化水平（p ERK1/2）的变化规律,采用流式细胞术检测g MC4R野生及突变质粒在细胞表面表达。系统分析了g MC4R野生及突变质粒在配体作用下细胞内的信号转导,为山羊遗传育种提供参考指标。研究结果如下:1.使用生物信息学对山羊MC4R进行分析,结果显示,山羊MC4R的分子式为C1664H2619N413O454S24,为不稳定疏水蛋白,亚细胞定位在细胞膜上,有7个跨膜结构,突变位点p.I168V可能会引起跨膜结构变化,其余突变位点跨膜结构无变化;突变体位点p.T9M、p.A112T、p.Y302*、p.F313S和p.I316L只检测出2种基因型,纯合子频率较高;剩余突变位点检测出3中基因型,纯合子频率下降。g MC4R蛋白有5个N-糖基化位点,10个O-糖基化位点,27个磷酸化位点;二级结构预测显示突变位点p.T9M,p.F313S,p.I316L会引起蛋白质理化性质以及蛋白二级结构发生变化,其余突变位点不会改变二级结构;山羊MC4R的系统进化树显示与绵羊的序列最相似;MC4R基因的互作蛋白作用主要是维持代谢稳态和能量平衡。2.基于山羊MC4R的编码区序列,设计引物,扩增获得野生型MC4R基因,然后将其连接至含-MYC和-e GFP标签的pc DNA3.1（+）真核表达载体,获得重组质粒后,利用定点突变技术进行突变。最终获得两组分别带MYC和e GFP标签的9个山羊MC4R突变体质粒:pc DNA3.1（+）-MYC/e GFP-g MC4R-WT/p.T9M/p.A36D/p.A112T/p.N120S/p.I168V/p.I204M/p.Y302*/p.F313S/p.I316L。3.利用双荧光素酶报告基因分析g MC4R转染后胞内基础c AMP水平,结果显示,突变体p.T9M的基础活性显著较高,p.F313S的基础水平显著低于野生型;其余突变体的基础活性与野生型均相差不大。使用不同浓度(10-5M-10-11M)α-MSH诱导细胞内c AMP水平结果显示,突变体p.T9M、p.I168V、p.I204M、p.I316L相较于野生型,激动剂敏感性增加,且细胞内c AMP产生量变多;尽管突变体p.A37D产生的c AMP量比野生型多,但敏感性降低。p.N120S的敏感性比野生型显著提高,但产生的c AMP量与野生型相似;仅p.A112T与野生型产生c AMP量相当,且敏感性一致。4.细胞内基础p ERK1/2水平和配体作用p ERK1/2水平结果显示,g MC4R野生型及突变体在受到配体α-MSH刺激时,p ERK1/的活性整体呈现增强趋势,其突变体p.A112低于基础水平,但结果并不显著;p.Y302*、p.F313S突变体的磷酸化ERK1/2活性略低于基础水平。5.流式细胞术检测细胞表面表达水平,结果显示突变体p.A112T、p.I204M、p.Y302*的细胞表面表达显著低于野生型,突变体p.I168V和p.I316L细胞表面表达水平显著高于g MC4R野生型,属于加强型突变。
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