论文部分内容阅读
本研究首先对层析纯化的四种鲢鱼卵小分子半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs),进行了基本理化性质和生物学活性特征的鉴定,为进一步深入研究鲢鱼CPIs性质奠定基础。同时研究了一种小分子CPI(类Cystatin-II,14KDa)对冷藏鲢鱼肉片中分离的优势腐败菌—假单胞菌的抑菌效果,该结果为将鲢鱼小分子Cystatin开发为水产品防腐、保鲜剂,以及综合、合理利用鲢鱼下脚料资源提供了理论依据。选取鲢鱼卵粗分离样品经Octyl Sepharose 4 Fast Flow层析后获得的四个活性峰,即峰Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ进行深入鉴定。电泳鉴定分子量：在还原Trincine-SDS-PAGE上,峰Ⅲ呈现17.5KDa和6.3KDa的两条带,将17.5KDa条带命名Cystatin-Ⅰ,峰V呈现19.9KDa和8.2KDa的两条带,将19.9KDa条带命名Cystatin-Ⅲ,峰Ⅳ和峰V1分别呈现14,5KDa(命名Cystatin-Ⅱ)和14.2KDa(命名Cystatin-Ⅳ)的一条蛋白条带。抑制条带的电泳法鉴定：首先通过,明胶底物SDS-PAGE反相酶谱法(方法A)、明胶底物Native-PAGE反相酶谱法(方法B)以及CPI与木瓜蛋白酶(Papain)反应后进行Tricine-SDS-PAGE法(方法C)三种电泳鉴定方法的比较,确定方法C为抑制条带的适宜鉴定法。体系为2.5μg小分子CPI与0.625μg Papain(1.25mg/mL的有效浓度6.05μmol/L) 37℃反应5h以上,进行Tricine-SDS-PAGE鉴定。用该法证明Cystatin-Ⅰ至Cystatin-Ⅳ均为半胱氨酸蛋白酶抑制剂条带。纯度及疏水性RP-HPLC鉴定：电洗脱得到的Cystatin-Ⅰ和Cystatin-Ⅲ及Cystatin-Ⅱ和Cystatin-Ⅳ分别上C18RP-HPLC鉴定纯度及疏水性。结果表明,Cystatin-Ⅰ(峰面积比例93.7%,拖尾因子10%为1.48)、Cystatin-Ⅱ(峰面积比例93.5%,拖尾因子10%为1.941)、Cystatin-Ⅲ(峰面积比例82.37%,拖尾因子10%为0.841)三个组分均在约14.2min呈现高纯度的单一洗脱峰,同时Cystatin-III在约92.3min(峰面积比例15.5%,拖尾因子10%为0.891)处也洗脱下一个强疏水性的单一峰。而Cystatin-IV(峰面积比例93.1%,拖尾因子10%为1.074)在约92.3min呈现高纯度的单一洗脱峰。Cystatin-IV经反复RP-HPLC,发现其保留时间由92.3min几乎全部转化为保留时间14.2min,说明其疏水性不稳定。测定两个保留时间的洗脱峰的抑制活性,结果表明,低疏水性的蛋白峰(保留时间14,2min)抑制活性降低,相比高疏水性蛋白峰(保留时间92.3min)几乎损失50%。生物学活性特性鉴定：测定了高纯度、高活性的Cystatin-II的生物学活性特性。其在pH3.0-7.0条件下稳定,残余活性几乎无损失,在pH11.0时,残余活性仍维持70%；热稳定性实验表明,Cystatin-II在4℃-60℃范围内,残余抑制活性几乎未损失,80℃时仍有近60%的残余活性。利用Dixon-plot作图法测得Cystatins-II抑制常数Ki为0.1341nmol,属于竞争性抑制剂。对假单胞菌J-4的抑制作用研究：对4℃冷藏鲢鱼肉片中分离的优势腐败菌进行鉴定,结果表明此菌株为革兰氏阴性杆菌,无芽孢；采用氧化酶、接触酶、精氨酸双水解酶实验以及葡萄糖氧化发酵(O/F)实验进行生化鉴定,结果均为阳性。进一步经16S rDNA序列比对分析表明,此菌株(GeneBank登录号KF056821)与GeneBank中登录号为NR024901、 NR043425、NR043422等的假单胞菌属菌种具有高达99%的同源性,系统进化树进一步表明此菌株属假单胞菌属。本实验对其命名为假单胞菌J-4。利用抑制剂滴定法,以Azocasein为底物,确定一个抑制活性单位即完全抑制体系中9.375μg (45.375μmol)的Papain所需Cystatin-Ⅱ的量为7.57μg。营养肉汤实验表明,假单胞菌J-4初始浓度相同时,Cystatin-Ⅱ的添加量为135units/mL组相比80 units/mL组和105units/mL组,有比较明显的抑菌作用。滤纸片实验中,Cystatin-Ⅱ的浓度300units/片和660units/片时,均有抑菌圈出现,前者菌圈直径较小,仅有8mm,而660units/片的抑菌圈最明显,最大处抑菌圈直径15mm。