盐生海芦笋及其内生真菌Salicorn 46次级代谢产物研究

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植物内生真菌种类繁多、分布广泛,且能产生结构和活性多样性的次级代谢产物,因此已成为发现新颖结构化合物的巨大资源宝库。在内生真菌次级代谢产物的研究过程中,传统的筛选方法是基于活性筛选和化学筛选或者二者的组合,这些方法最大的缺点就是常常导致已知微生物和已知化合物不断重复的发现。近年来,随着分子生物学的发展,基于聚酮合酶(polyketide synthases, PKS)功能基因的定向筛选方法已经成为发现新型化合物的重要策略之一盐生海芦笋(Salicornia bigelovii Torr.)生长在高盐环境中,能够产生结构新颖与活性多样的化合物,而且研究证实盐生海芦笋中蕴藏着多种内生真菌,这些内生真菌往往能够产生多种活性次级代谢产物。本研究利用有机溶剂对盐生海芦笋进行萃取,得到乙酸乙酯提取物;采用硅胶柱层析,Sephadex LH-20凝胶柱层析等分离手段对其分离纯化,得到4个单体化合物;通过现代波谱学方法及相关文献数据比对确定了这些单体化合物的结构分别为oleic aicd (1), (3 β,5a,8a,22E)-5,8-epidioxyergosta-6,9,22-trien-3-o1 (2), pentadecyl ferulate (3)和scopoletin (4)。采用PDA平板法和斜面法从盐生海芦笋中分离纯化出两株编号分别为Salicorn54和Salicorn 46的内生真菌,并利用PCR技术进行真菌Ⅰ型PKS功能基因筛选,在菌株Salicorn 46中分离得到1条PKS KS基因片段,BLAST比对结果表明该基因序列与GenBank里已知的生物合成相关的PKS基因有较高相似性(90-95%)。通过系统发育分析表明,该PKS KS序列独成一枝,提示该菌株可能具有产生新的聚酮化合物的潜力。利用形态学与分子生物学相结合的方法将Salicorn 54 和 Salicorn 46分别鉴定为甜菜蛇眼茎点菌Phoma betae和柑桔青霉菌Penicillium citrinum。对菌株Salicorn 46进行大量发酵、溶剂萃取、柱层析分离纯化得到8个单体化合物,利用核磁共振、红外、紫外、质谱、气质联用等波谱学手段鉴定其化学结构分别为:penicitriketo (5)、ergone (6)、(3 β,5a,8a,22E)-5,8-epidioxyergosta-6,9,22-trien-3-o1 (7)、 (3 β,5a,8a,22E)-5,8-epidioxyergosta-6,22-dien-3-o1 (8). stigmasta-7,22-diene-3 β,5 a,6 α-triol (9).3 β,5 α-dihydroxy-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6 β-yl oleate (10)、Nb-acetyltryptamine (11)和2-(1-oxo-2-hydroxyethyl) furan(12).采用DPPH法对分离得到的12个单体化合物进行抗氧化活性初步评价。结果表明:这12个单体化合物均能在一定程度上清除DPPH自由基,但清除能力相差较大。其中,化合物3和5清除DPPH自由基的能力最强,且与阳性对照VE的DPPH自由基清除活性最为接近。采用8种指标菌对分离得到的单体化合物进行抑菌活性筛选,结果为:化合物6-10都表现出了不同程度的抑菌活性,其中化合物6表现出明显的广谱抑菌活性,能抑制白色念珠菌、产气荚膜梭菌、耻构分枝杆菌以及草分枝杆菌的生长,MIC值分别为25.5±0.48、25.5±0.25、18.5±0.34和51.0±0.68μM。化合物7对产气荚膜梭菌和四联球菌也表现出明显的抑菌活性,MIC值均为23.5μM。化合物9和10都具有选择性抑菌活性,分别抑制枯草芽孢杆菌和草分枝杆菌的生长,MIC值分别为22.5±0.45和14.4±0.34μM。
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