猪流感（Swineinfluenza,SI）主要在猪群中呈现地方性流行,猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）是重要病原,主要包括H1N1,H1N2和H3N2亚型。该病毒也易于在猪体内与其他亚型流感病毒重组,导致对人类的易感风险增强。中国拥有最复杂的SIV生态系统,包括经典谱系（Classic swine influenza,CS）、北美三元重组谱系（Northern american triple reassortant,TR）和欧亚类禽谱系（Eurasian avian-like,EA）,造成SIV流行和演化越来越复杂。因此,开展持续的SIV流行病学监测和演化分析、评估病毒毒力变化规律、积累诊断储备工具,对于预警和防控SI具有重要意义。本研究首先在2019-2020年度对扬州地区屠宰场猪只开展鼻拭子样品采集,并对SIV分离鉴定、全基因组测序和演化分析;其次,评估了 H1亚型SIV对小鼠的致病性;最后,研制了针对H1N1亚型SIV的单克隆抗体用于诊断技术储备。具体研究内容如下。1.2019-2020年度扬州地区猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析2019-2020年度在江苏省扬州地区某个屠宰场对屠宰猪只持续采样,共采集鼻拭子样品802份。通过SPF鸡胚接种法分离病毒,以血凝试验结合RT-PCR方法进行病毒亚型鉴定,最终共成功分离到2株H1亚型SIV,分离率为0.25%。其中1株为H1N1亚型,命名为 A/Swine/Jiangsu/1070/2019（JS1070）;另1株为 H1N2 亚型,命名为A/Swine/Jiangsu/1281/2019（JS1281）。HA基因遗传进化分析表明,两株SIV均属于EA谱系,HA基因的碱性裂解位点模式均为339PSIQSR↓ G347,符合低致病性的分子特征。NA基因分属不同谱系,JS1070属于EA谱系,JS1281属于TR谱系。2株病毒的内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因均属于CS谱系。2.猪流感分离株的生物学特性及小鼠致病性研究通过有限稀释法将病毒分离株进行纯化,随后对病毒株的生物学特性及对小鼠的致病性开展研究。JS1070病毒和JS1281病毒在鸡胚上的半数感染量（EID50）分别为7.7 lg/0.1 mL和 8.5 lg/0.1 mL,在 MDCK细胞上的半数感染量（TCID50）分别为 5.22 lg/0.1 mL和6.24 1g/0.1 mL,病毒最小致死剂量致死鸡胚所需的平均时间（MDT）分别为81 h和69 h。将JS1070和JS1281毒株以106 EID50滴鼻感染6周龄BALB/c小鼠,结果显示,JS1070病毒感染导致小鼠体重下降,最严重时接近10%,小鼠的存活率为66.7%;而JS1281体重下降高达22.3%,小鼠存活率为50%。病理组织切片结果显示,两株SIV均能引起肺部组织发生严重的病变;脏器病毒载量测定结果显示,两株病毒在心脏中的病毒载量仅在第3 d可检测到,但在肺脏中的病毒载量在感染后第9 d仍能检测到,而且JS1281在心脏和肺脏中的病毒载量均高于JS1070;感染组肺脏中的细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的表达水平与对照组相比均显著上调,其中JS1281诱导的细胞因子上调水平高于JS1070。上述结果表明,2株H1亚型SIV分离株均能导致小鼠致病,且JS1281株对小鼠的毒力强于JS1070株。3.H1N1亚型SIV单克隆抗体的研制选择H1N1亚型SIV JS1070分离株进行HA单克隆抗体的研制。病毒经蔗糖浓度梯度离心法纯化并用甲醛灭活后制备油乳灭活疫苗,经腹部皮下免疫6周龄BALB/c小鼠,三免后腹腔注射进行加强免疫,72 h后取其脾细胞制备杂交瘤细胞。通过血凝抑制（HI）法筛选阳性克隆,最终得到7株能稳定分泌抗体的单克隆抗体杂交瘤细胞,分别命名为1B7、3C10、3D6、3D7、4F11、5B6和5C11。HI结果显示,7株单抗均对H1N1亚型SIV JS1070株具有血凝抑制性（7～8 log2）。抗体亚类鉴定结果显示,1B7的亚类为IgG3、3D6和5C11的亚类为IgM,3D7的亚类为IgG2a,3C10、4F11和5B6的亚类为IgG1。HI和间接免疫荧光试验（IFA）结果显示,除了 3D6和5C11以外,其他5株单抗均与母本株JS1070具有反应性,与H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10的流感病毒无交叉反应,表明单抗特异性好;其中3C10单抗对猪源H1N2亚型毒株JS1281、禽源H1N1亚型毒株JY、人源H1N1亚型毒株PR8及CA09具有更好的交叉反应性,表明该单抗广谱性好;3C10单抗同时也具有更好的中和抗体特性和免疫印迹特性。综上所述,3C10单抗综合特性更好,可应用于后续H1亚型流感病毒的免疫学诊断方法的开发。