研究背景：糖尿病（Diabetes mellitus，DM）及其诱发的严重慢性并发症累及全身多个组织器官，具有高发病率，高致死率的特点，严重威胁了人类的健康。糖尿病与心血管疾病的关系十分密切，目前心血管并发症是导致糖尿病患者死亡的首要原因。其中，高糖致心肌损伤是糖尿病严重心血管并发症之一。研究发现糖尿病患者的慢性高血糖环境可导致心肌结构和功能异常改变，并可进一步进展为糖尿病心肌病，增加心力衰竭的风险。同时，糖尿病心肌损伤也是心肌缺血易损性增高的重要原因，糖尿病患者发生心血管事件的预后明显差于非糖尿病患者。明确高糖导致心肌损伤的机制，寻求高糖状态下心肌保护的新靶点，对于降低糖尿病心源性死亡率具有重要意义。以往研究表明，糖尿病心肌损伤的发病机制中多以蛋白激酶C（Protein kinaseC，PKC）的激活为共同通路。PKC过度激活促使心肌细胞氧化应激加剧，钙离子转运障碍，心肌细胞凋亡增加，最终导致心肌结构异常和收缩功能障碍。然而，高糖状态下PKC激活及下游信号调控的具体分子机制尚有待进一步阐明。A型激酶锚定蛋白（A-kinase anchoring proteins，AKAPs）是激酶调节蛋白家族成员，通过和多种激酶结合增强激酶的功能，从而起到调节信号通路的作用。最初发现AKAPs与蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）结合，调节PKA活化而引起科学界的关注。多项研究表明，AKAPs通过与激酶特异性锚定结合，可明显增强激酶下游信号传递速度和扩增强度，同时能增加激酶下游信号传递的准确性。目前AKAPs的正常生理功能及在多种疾病中的作用越来越受到关注。其中，AKAP79/150由AKAP5基因编码（在人体内为AKAP79，在啮齿动物体内为AKAP150），能与PKA、PKC、钙调磷酸酶等蛋白锚定结合，调控cAMP、钙离子、磷脂酶等信号通路活性。在动脉血管平滑肌细胞中发现，AKAP79/150可介导PKC的细胞膜转位激活过程，并偶联激活膜上离子通道L-type Ca2+channel，发挥调控血管张力重要作用。然而目前尚无研究报道AKAP79/150在高糖心肌损伤中的作用。据此，本课题拟从整体动物和细胞水平探讨AKAP150是否参与高糖致心肌损伤，AKAP79/150对PKC信号可能的锚定调控及其分子机制。研究目的：1.动物及细胞水平明确高糖致心肌损伤的特点，以及AKAP150表达，PKC活性的改变；2.动物及细胞水平明确AKAP150在高糖致心肌损伤中的作用。3.细胞水平阐明AKAP150介导糖尿病心肌损伤的机制，即AKAP150特异性锚定激活PKC、β亚型，调控PKC/p47phox/ROS信号加重心肌细胞氧化应激和凋亡；调控PKC/PLB/SERCA信号导致心肌细胞内钙离子浓度异常升高导致细胞损伤。研究方法：1.选取体重为220-250g雄性SD大鼠，大鼠腹腔注射STZ溶液（35mg/kg/d），连续注射3天。7d后取大鼠尾静脉血，全自动血糖仪监测血糖水平，以2次随机血糖水平≥16.7mmol/L鉴定造模成功。2.分离培养乳鼠心肌细胞，使用25mmol/L葡萄糖培养心肌细胞模拟高糖环境。3.运用心肌组织内注射AKAP150腺病毒shRNA及培养心肌细胞转染AKAP150腺病毒shRNA的方法，以降低心肌AKAP150蛋白表达水平。4.运用小动物超声检测大鼠心功能。5.运用TUNEL法、Caspase3活性测定、流式细胞术方法检测心肌组织及心肌细胞凋亡。6.运用超氧化物试剂盒、超氧离子探针及脂质氧化试剂盒检测心肌细胞氧化应激水平。7.运用NADPH氧化酶活性检测试剂盒检测心肌细胞NADPH氧化酶活性。8.运用Fluo-3AM试剂盒检测心肌细胞胞浆钙离子浓度。9.运用非放射性蛋白激酶C活性试剂盒检测心肌细胞PKC活性。10.运用SERCA2ELISA试剂盒检测心肌细胞SERCA2活性。11.运用RT-PCR检测心肌组织及心肌细胞AKAP150，PKC，p47phox，NF-κB mRNA水平。12.运用Western blot法检测心肌组织及心肌细胞AKAP150，PKC，p47phox，NF-κB，PLB的表达或磷酸化水平。13.运用免疫荧光染色和免疫共沉淀方法检测心肌细胞AKAP150与PKC的结合和共定位。研究结果：1.与正常大鼠相比，糖尿病大鼠心脏舒张功能显著降低，心肌细胞凋亡显著增多。与正常培养心肌细胞相比，高糖培养导致心肌细胞ROS水平、凋亡显著增多及胞浆钙离子浓度异常升高。糖尿病大鼠心肌组织及高糖培养大鼠心肌细胞AKAP150，PKC表达及PKC活性明显升高，PKC的下游分子p47phox、p65NF-κB表达及活性也显著升高。2.降低心肌内AKAP150表达可改善糖尿病导致的心脏舒张功能障碍，减少心肌细胞凋亡。3.降低心肌细胞AKAP150表达可减轻心肌细胞氧化应激水平和心肌细胞凋亡，抑制NADPH氧化酶活性，并降低心肌细胞胞浆钙离子浓度。4.降低AKAP150表达后高糖培养大鼠心肌细胞PKC活性显著降低，p47phox，NF-κB活性显著降低。5.降低AKAP150表达后高糖培养大鼠心肌细胞PLB和SERCA2活性显著上升。6.免疫荧光及免疫共沉淀结果显示：高糖培养大鼠心肌细胞PKC生成增多并由胞浆向胞膜转位，与AKAP150共定位结合。而降低AKAP150表达后，PKC膜转位减少，AKAP150与PKC结合显著降低。7.免疫荧光结果显示：高糖培养大鼠心肌细胞AKAP150与PKC、β亚型结合，而非PKCγ,且PKC、β特异性抑制剂能够降低高糖导致心肌细胞的ROS水平，凋亡和胞浆钙离子浓度。研究结论：1.糖尿病导致心肌舒张功能不全，心肌细胞氧化应激、凋亡和胞浆钙离子浓度升高，其机制可能与高糖增加心肌细胞内AKAP150表达及PKC活性有关；2.降低AKAP150表达，可减少高糖状态下PKC转位激活，进而改善高糖所致心肌细胞损伤。3.在高糖致心肌损伤过程中，AKAP150表达增加并进一步锚定和激活PKC亚型、β，通过PKC/p47phox/ROS通路导致心肌细胞的氧化应激和凋亡，通过PKC/PLB/SERCA2降低肌浆网对钙离子的重摄取，导致胞浆钙离子浓度异常升高，共同导致心肌细胞损伤。