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本研究对庆大霉素结构上的绛红糖胺基团进行了改造,拟探讨绛红糖胺上C6’位上的甲基化与工程化。同时对相应重要产物G418进行从工程菌构建到产业化过程的研究。具体内容如下:1、绛红糖胺工程化的探索。以绛红小单孢菌GK1101(G1008△genK)为出发菌,构建genM2基因缺失工程菌GKM2805。结合MS分析,该工程菌发酵产物中未检测到庆大霉素C族组分,只有极少量的D-葡萄糖胺和2-脱氧链霉胺,因此推测genM2参与由2-脱氧链霉胺和D-葡萄糖胺合成巴龙霉胺的生物合成途径。2、绛红糖胺甲基化基因的探索。以绛红小单孢菌G1008为出发菌,构建genW基因缺失工程菌GW506。其发酵产物经TLC和MS检测结果与出发菌一致,而且发酵单位也与出发菌无明显差异,表明genW基因不参与庆大霉素生物合成,更不是绛红糖胺甲基化基因。3、ermE替换genQ工程菌GQ408的构建。以绛红小单孢G1008为出发菌,构建出工程菌GQ408,经TLC和MS分析,其代谢产物主要为G418,但是发酵单位相比出发菌株明显下降,推测是由于外源基因ermE的导入,影响了 GQ408工程菌体内庆大霉素生物合成基因的正常表达,主要是表达水平的下降。4、G418生产菌的产业化探索。以主产G418的工程菌GQ175(G1008△genQ)为基础,通过连续传代,考察了其产孢质量和发酵单位的稳定性。通过单因素法和正交试验优化了其发酵培养基配方,使得发酵单位提高了 50%;在200L发酵罐上进行放大试验,罐上发酵单位达到了 200 u/mL,相比提高了一倍,为菌种从实验室向企业过渡的关键转移作出了前期探索。5、D152树脂分离纯化G418的研究。选择氨基寡糖层析分离常用的大孔弱酸性树脂D152进行研究,考察了静态和动态交换容量进行考察,结果表明,在中性条件下,树脂交换容量最大,其饱和交换量分别为27.0 mg/mL和31.5 mg/mL;通过对影响树脂分离纯化的主要因素(树脂粒径、解吸pH和解吸流速)进行考察,结果是树脂粒径为100目,解吸pH为10.5、解吸流速3/400V/V.min较合适。在此条件下,层析的洗脱率为86.3%,G418纯度达到91.2%;建立了使用D152树脂层析分离,去除杂质,制备G418的工艺流程,简便易行。