热泉具有高温的环境特点,其中蕴含多种嗜热微生物,独特的生长环境造就了具有特殊生理机制和独特基因的物种,是发现未知或具有特殊功能酶类的理想场所。蛋白酶可以催化蛋白质的水解,在酶学性质的研究中有很长的历史。蛋白酶同样也是重要的工业酶制剂,应用广泛,但当前存在着热稳定性差的局限性。本研究课题以腾冲热泉中收集到的微生物为研究对象,通过培养分离,筛选,基因组学等方法对嗜热原核微生物展开研究。本实验研究中,针对从云南腾冲热泉取得的水样进行产酶功能筛选,得到一株表达高温蛋白酶的菌株。首先对其进行驯化培养,主要是利用选择培养基筛选能够分解脱脂奶粉产蛋白酶的菌株;同时探究温度、pH、碳源、氮源对菌株生长的影响;最后采用福林酚法测定蛋白酶活性,并对酶的最适pH、温度以及热稳定性、pH稳定性进行测定研究。实验结果筛选得到一株产蛋白酶菌株,经过生理生化试验和16S rDNA鉴定得到该菌株是Aneurinibacillus属。菌株生长的最适氮源、碳源、温度和pH分别为酵母粉、葡萄糖、55℃、pH 7.5。此外该菌株所产的蛋白酶最适温度为60℃,在pH7~9具有较好的酶活性。因此筛选得到的菌株为嗜热芽孢杆菌,所产的碱性蛋白酶具有较高的耐受温度和pH稳定性。采用PCR技术克隆比对后确定丝氨酸蛋白酶基因spr,连接表达载体,构建pET-28a-spr原核表达载体,转化Trans1克隆感受态细胞,将验证成功的阳性克隆转化BL21大肠杆菌,17℃下IPTG诱导表达,破碎细胞,与空载对比后测定酶活。经测序表明,该蛋白酶基因为丝氨酸蛋白酶,全长1206bp,编码含有400个氨基酸残基的成熟蛋白,等电点为5.3,蛋白酶分子量约为42kDa。与大肠杆菌表达系统相比,枯草芽孢杆菌表达系统可以有效的将重组蛋白分泌到细胞外。构建PHY-spr表达载体,在Trans1感受态细胞中克隆,再转入SCK6枯草芽孢杆菌中表达,利用配制好的发酵培养基进行发酵培养72h,与空载对照测定酶活。以腾冲热泉为研究对象,通过对不同热泉微生物的研究可加强我国对高温热泉微生物与高温酶资源的研究与利用。