[研究目的]放射治疗是目前应用于肺癌治疗的重要方式之一,而放射治疗后仍然有一部分患者发生局部复发和远处转移,而导致其复发和转移的重要原因是肿瘤细胞存在的“放疗抵抗”现象。在多种肿瘤中上皮间质转换(EMT)与“放疗抵抗”相关,在转移灶形成、发展的过程中,EMT并非必需过程,然而发生EMT的细胞显著促进了化疗后复发性肺转移灶的形成。抑制EMT可能为减少放疗抵抗细胞的产生,提高肿瘤的放疗敏感性提供新的方式。放疗不仅通过直接细胞毒性作用发挥对肿瘤细胞的直接杀伤作用,也可以募集并调节肿瘤微环境(TME)中的多种细胞发挥间接抗肿瘤作用。中性粒细胞是放疗后首先募集到肿瘤部位的炎症细胞。局部浸润的中性粒细胞释放细胞因子,进一步诱发相关反应研究发现,与正常骨髓产生的中性粒细胞(neutrophil)相比,肿瘤新募集的肿瘤浸润中性粒细胞(TAN)产生活性氧簇(ROS)的水平明显增高。多篇研究证实,ROS可以调控PI3K/AKT信号通路的激活,而AKT的激活发现可以在多种恶性肿瘤中诱导EMT的产生。放疗后TAN募集及调控的机制以及新募集的TAN对肿瘤细胞的EMT和放疗敏感性的作用尚未阐明。[研究方法]1、标准方案培养小鼠Lewis(LLC)细胞。在6孔培养板中孵育细胞,并分别在第1、3和5天以8Gy的剂量(6-MV高能光子射线)进行RT处理。我们评估了 RT后一天释放的趋化因子。使用Mouse Cytokine Array Panel A对细胞上清液评估40种具有炎症,体内平衡或双重功能的小鼠细胞因子。为了确认特定细胞因子的作用,分别将照射处理后12 h,1d,2d,3d,5 d和7d的细胞在2000 rpm下离心10min后获得的上清液视为条件培养基。通过ELISA对多种细胞因子进行评估。此外,采用雌性6周龄的C57BL/6小鼠,在其右侧腋下种植1’*10^6个LLC细胞,待肿瘤直径达到6mm。隔日测量肿瘤最长径(a)和最短径(b),以计算肿瘤体积。使用CXCL1,CXCL2和CCL5中和抗体,实验分组为对照组、RT组和RT联合中和抗体组。免疫组化、流式细胞术检测中性粒细胞浸润程度;ELISA和qRT-PCR检测CXCL1,CXCL2和CCL5的表达水平;体内外综合筛选出调控中性粒细胞募集的关键细胞因子。2、体内实验部分,通过中性粒细胞中和抗体(Anti-Ly6G),导致TAN消融。使用临床药物G-CSF,协同增加TAN募集。实验分组:对照组、RT组、RT+anti-Ly6G组、G-CSF组、RT+G-CSF组。收集荷瘤鼠肿瘤组织、脾脏及前哨淋巴结,制备单细胞悬液,利用流式细胞分选技术,分析各组荷瘤鼠的肿瘤组织、脾脏、和前哨淋巴结的TAN细胞、CD4+细胞、CD8+T细胞的浸润水平;从单细胞悬液中利用EasySep PE分选试剂盒分选Ly6G+的粒细胞,使用流式细胞技术检测不同中性粒细胞ROS的生成量,Western blotting、qRT-PCR检测肿瘤组织PI3K/AKT信号通路的激活情况,Western blotting、qRT-PCR、免疫组织化学检测肿瘤组织E-cadherin、Vimentin、Snail等EMT相关指标的表达,观察移植瘤的生长情况。数据处理及分析:采用非参数检验比较不同分组间各连续性变量的分布差异。生存差异采用K-M生存曲线分析,P<0.05认为存在统计学差异。[结论]1.RT招募中性粒细胞依赖于细胞因子,TAN作为免疫应答的第一线在局部照射后第3天,研究了 CD1 1b+Ly6G+TAN在肿瘤和脾脏中的浸润情况。发现在受辐照的小鼠模型中,TAN显着高于对照组,尤其是与G-CSF一起给药的小鼠。随后,我们以时间依赖性方式研究了放射后肿瘤中嗜中性粒细胞的募集以及肿瘤特异性CTL。结果表明,募集的中性粒细胞在照射后24h达到峰值,此后,CTL开始缓慢增加并在60h达到峰值。这种现象表明RT募集了中性粒细胞作为免疫应答的第一线。另外,肿瘤内抗Ly6G抗体的施用分别导致被辐照小鼠的肿瘤和脾脏中嗜中性白细胞减少约60%和80%(P<0.05)。2.放疗导致肿瘤细胞DNA持续损伤,释放细胞因子。为了验证CXCL1/CXCL2/CCL5在TAN募集中的作用,给小鼠注射了相应的抗体。与对照组相比,CXCLI/CXCL2/CCL5的同时阻断可能在很大程度上阻碍了辐射介导的中性粒细胞募集(P<0.001)。此外,每种中和抗体的使用也可能导致TAN募集下调,尽管不如同时阻断所有三种细胞因子有效(分别对于CXCL1,CXCL2 和 CCL5 分别为 P=0.008、0.012 和 0.023)。CXCL1,CXCL2和CCL5与模式识别受体(PRRs)识别的病原体反应如趋化因子(PARC)现象相关联,进而激活了病原体相关分子模式(PAMPs)。3.放疗募集TAN逆转上皮间质转换,促进抗肿瘤反应通过IHC评估照射后48 h肿瘤,脾脏和引流淋巴结中CTL的浸润水平。与对照组相比,在RT处理的小鼠中,特别是在同时给予G-CSF的小鼠中,观察到CTL的显着上调(所有P<0.05)。与对照组相比,在接受放疗的TAN减少的小鼠中,CTL的募集在肿瘤(P=0.031)和淋巴结(P=0.029)中得到显着抑制。G-CSF给药增强了 RT介导的TAN在肿瘤中的CTL浸润(P<0.001),脾脏(P=0.028)和引流淋巴结(P=0.033)。通过IHC染色,qRT-PCR和Western blotting在带有LLC的小鼠模型中检测到上皮和间充质标记。与对照小鼠相比,经RT处理的小鼠模型表现出典型的EMT表型逆转现象,包括E-cadherin上调和Vimintin下调(P<0.05)。通过G-CSF给药进一步增强了对EMT的抑制。另外,在肿瘤中,中性粒细胞水平与E-cadherin表达之间建立了显著的正相关(相关系数=0.624,P=0.041),与波形蛋白呈负相关(相关系数=-0.673,P=0.032)。在放射治疗的5天中,用抗Ly6G mAb治疗了受辐射的小鼠。嗜中性粒细胞耗竭的小鼠显示出Vimintin上调和E-cadherin下调,但是与对照组小鼠相比无明显统计学差异(P>0.05)。4.TAN通过ROS介导的PI3K/Akt/Snail信号通路抑制EMTWestern blot检测TAN对肿瘤组织中PI3K/Akt/Snail活性的影响:在同时接受RT和G-CSF的小鼠模型中,PI3K/AKT的磷酸化水平显著降低。同样,通过WB(P=0.014)和qRT-PCR(P=0.002)检测,在小鼠模型中Snail的表达水平也下调。此外,仅RT会对PI3K/AKT磷酸化产生相似但较弱的抑制作用(P<0.05)。与未经辐照的肿瘤的正常嗜中性粒细胞相比,在RT诱导的TAN中观察到了 ROS积累的增加(P=0.003)。