水稻是一种重要的粮食作物,而稻瘟病是最严重的水稻病害之一。在过去的几十年中,针对稻瘟病抗性的研究取得了重要的进展。越来越多的研究表明mi RNA及抗病基因（R基因）在调控稻瘟病的抗性方面发挥着重要的作用。因此十分必要深入研究mi RNA和R基因在稻瘟病抗性中的作用机制。在前期的实验中,我们通过对水稻感病材料和抗病单基因系材料接种稻瘟菌,鉴定了一批响应稻瘟菌侵染,而且在抗感不同的水稻材料中有表达差异的s RNA,Osa-mi R167d便是其中一个,但是Osa-mi R167d是否参与水稻抗病性及如何参与仍需要深入研究。此外,我们在水稻中异源表达拟南芥广谱抗病基因RPW8.1,能够增强水稻对稻瘟病的抗性,但RPW8.1介导的抗性机制是如何被调控的依然不清楚。因此,本文以水稻和拟南芥作为实验材料,重点研究Osa-mi R167d和RPW8.1调控植物免疫反应的机制。MiR167属于一类保守的miRNA,在前期的研究中,通过降解组测序及RACE实验,证明Osa-mi R167d共有7个靶基因,其中包含4个生长素响应因子（ARF）基因。因此,在本实验中,首先我们对感病材料丽江新团黑谷（LTH）和抗病单基因系材料IRBLkm-Ts接种稻瘟菌,在接种后的不同时间点取样并提取样品的总RNA,检测Osa-mi R167d在抗感水稻材料中,受稻瘟病菌侵染前后的表达模式,以便验证前期转录组的数据。实验结果表明,在接种稻瘟病菌24 h及以后,Osa-mi R167d在抗病材料IRBLkm-Ts被显著抑制。而在接种稻瘟菌24 h的感病材料LTH中,Osami R167d的表达显著上调。以上结果说明Osa-mi R167d能够响应稻瘟菌侵染。因此,我们以籼稻kasalath的基因组DNA为模板,构建以35S为启动子,启动表达Osami R167d的载体。再以Kasalath为背景材料,获得过表达Osa-mi R167d的转基因水稻材料,并对阳性过表达水稻材料进行了初步的抗性鉴定。实验结果表明,Osami R167d过表达材料更感稻瘟病。在接种GFP标记的荧光菌Zhong-8-10-14（GZ8）后,我们发现Osa-mi R167d过表达材料中,GZ8的侵染速度相比于对照材料明显变快了,而且受稻瘟菌侵染,Osa-mi R167d过表达株系的防御相关基因和细胞死亡相关基因的表达量显著低于对照材料,并且在叶片上稻瘟菌侵染的位置,很难发现有过氧化氢累积。此外,我们进一步测定了Osa-mi R167d过表达材料的JA含量,结果表明其JA含量显著低于对照材料。人工诱捕靶标是研究miRNA功能的一个重要工具,它能够通过与mi RNA的结合而抑制mi RNA对其靶基因的调控功能。因此,我们通过构建人工诱捕靶标来抑制Osa-mi R167d,减弱Osa-mi R167d对其靶基因的抑制作用,从而进一步研究和明确Osa-mi R167d在水稻对稻瘟病抗性及调控水稻生长发育中的作用。我们设计针对Osa-mi R167d的人工诱捕靶标MIM167d,并通过35S强启动子启动表达该序列。以Kasalath作为遗传转化的背景材料,获得阳性转基因水稻材料后进行稻瘟病抗性鉴定。实验结果表明,过表达MIM167d的水稻材料更抗稻瘟病,而且防御相关基因和细胞死亡相关基因在受稻瘟菌诱导的时候,其表达量相对于对照材料显著上调,叶片上稻瘟菌的侵入位置有大量的过氧化氢的累积,且JA的含量显著高于对照材料。为了进一步明确Osa-miR167d是如何参与调控水稻对稻瘟病的免疫反应,我们对Osa-mi R167的靶基因进行了仔细分析,并检测了其靶基因在抗感水稻材料接种稻瘟菌后的表达模式。实验结果表明,Osa-mi R167d的靶基因在抗感材料中都响应稻瘟病菌的侵染。查阅文献发现,ARF12作为Osa-mi R167d的靶基因,参与调控水稻Os GH3-2基因的表达,而过表达Os GH3-2的水稻材料更抗稻瘟病。我们实验中发现ARF25和ARF12在LTH材料接种稻瘟菌后,有相反的表达模式。因此,我们首先重点研究ARF12和ARF25两个靶基因。通过CRISPR/Cas9技术,我们在水稻材料Kasalath中分别敲除了ARF12和ARF25基因,获得纯合突变体材料并接种稻瘟菌进行抗性鉴定。和对照材料相比,arf12突变体更感稻瘟病,而arf25突变体对稻瘟病的抗性与对照相比并没有显著变化。综上所述,Osa-mi R167d通过调控其靶基因ARF12,进一步负调控水稻对稻瘟病的抗性。Osa-miR167d不仅参与调控水稻对稻瘟菌的免疫反应,而且还参与调控水稻的生长发育。过表达Osa-mi R167d导致水稻株高变矮,分蘖数减少,分蘖角度变大,叶片近叶尖端皱缩,叶鞘叶绿素含量升高,闭花受精,花丝、柱头和浆片发育异常,结实率降低,千粒重减少,生育期延长的生长发育表型;而过表达MIM167d也导致了水稻株高变矮,叶鞘叶绿素含量降低,花丝、柱头和浆片发育异常,结实率降低,千粒重减少的生长发育表型。综上所述,Osa-mi R167d参与调控水稻对稻瘟病的免疫反应,并参与调控水稻的生长发育,因此明确Osa-mi R167d在水稻中的功能有望为水稻分子育种提供理论依据。拟南芥广谱抗病基因RESISTANCE TO PORDERY MILDEW 8.1（RPW8.1）是在Ms-0生态型中克隆得到的,它编码一类非典型的R蛋白。在前期的研究中,我们发现在水稻中异源表达RPW8.1能够增强水稻对稻瘟病的抗性。当在拟南芥中使用RPW8.1自身启动子启动表达该基因的时候,其定位在叶肉细胞的叶绿体周围,并促进拟南芥对病原菌的广谱抗性。在Col-gl背景下,以PRW8.1的自身启动子表达该基因,得到的稳定转基因拟南芥株系R1Y4的叶片能够产生自发的细胞死亡,且增强了拟南芥抗病性。此外,通过酵母文库筛选,我们鉴定到了一个与RPW8.1互作的蛋白ACO4,该蛋白是乙烯合成途径的关键的ACC氧化酶。而且RPW8.1能够稳定ACO4蛋白,增加乙烯产量,并增强乙烯信号。但是,在R1Y4背景下突变ACO4,EIN2和EIN3 EIL1后,我们发现这些材料的细胞死亡及抗性相比于R1Y4都显著增强。相反的,在R1Y4背景下过表达EIN3后的材料的细胞死亡和抗性被显著抑制。此外,我们还发现R1Y4的自发性细胞死亡是局限性的,说明RPW8.1介导的细胞死亡及抗性是受严格的调控的,而乙烯信号很可能就是RPW8.1介导的免疫的严格调控因子。因为RPW8.1能够激活乙烯信号,且乙烯响应因子在乙烯信号转导中有着重要的作用,因此,我们就尝试鉴定是否有乙烯响应因子能够调控RPW8.1表达,进而影响RPW8.1介导的细胞死亡及抗性。通过荧光素酶报告系统,我们筛选到了三个能够抑制RPW8.1表达的乙烯响应因子,分别是ERF6,ERF016和ORA59。随后的酵母单杂交及EMSA实验证明,ORA59能够绑定到RPR8.1的启动子的T/A-rich motif。此外,通过CRISPR/Cas9技术,在R1Y4背景下敲除ERF6,ERF016和ORA59后,这些突变体中RPW8.1的表达量都有所提高,且细胞死亡及抗性相比于对照有所增强。最后,我们对Col-gl和R1Y4两种材料,在不同的时间点取样,检测ORA59和RPW8.1的表达情况,发现它们有协同表达的趋势。综上所述,我们鉴定到了RPW8.1介导的细胞死亡及抗性的调控因子,明确了拟南芥的生长与RPW8.1介导的免疫反应之间是如何平衡的调控机制。