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研究背景原发性肝癌(HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一,发病率及死亡率在所有恶性肿瘤中均位居前列。由于起病隐匿,高度侵袭性及易出现转移,确诊时绝大部分患者已经属于晚期,失去根治性切除的时机。尽管近年来原发性肝癌治疗手段有一定程度的进展,但其长期生存仍不能令人满意。因此深入探究原发性肝癌侵袭转移背后的分子基础至关重要。大量研究表明,持续活化的内质网应激(ERS)与肿瘤的发生发展密切相关,内质网应激状态下,三种跨膜蛋白必需肌醇1α(IRE1α),蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)和活化转录因子-6(ATF6)激活未折叠蛋白反应(UPR)的三条通路。其不仅可以通过修复损伤蛋白质或降解错误折叠蛋白,保护肿瘤细胞避免机体杀伤,还可调控肿瘤细胞的生长,通过多种途径促进肿瘤侵袭转移,介导化疗耐药。在长期持续严重的内质网应激作用下,甚至可以诱导肿瘤细胞的凋亡。在内质网应激状态下,TRIB3作为细胞应激的传感器表达上调。TRIB3是哺乳动物伪激酶tribbles家族的成员之一,在未折叠蛋白反应中起着关键作用,它参与肿瘤的进展,并与预后不良有关。转录因子Sp2(transcription factor 2)是Sp蛋白家族中的一员,参与细胞增殖、分化、凋亡等多种功能的调节。研究表明Sp1可通过调控肿瘤相关基因的表达从而影响包含肝癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌等多种肿瘤的发生和发展。而转录因子Sp2与肿瘤的关系鲜见报道。近期研究结果表明,Sp2可能在胃癌、前列腺癌中过表达并发挥重要促癌作用,而Sp2在肝癌中的作用尚无研究。因此本研究旨在研究Sp2在肝癌中表达与临床病理特征的关系,进一步阐明其对肝癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响,并探讨其可能的分子机制。目的1.探究Sp2在肝癌中的表达情况及其表达与临床病理特征的关系。2.阐明Sp2在肝癌细胞系增殖、侵袭、迁徙及凋亡中的作用。3.进一步探讨Sp2发挥促癌作用可能的分子机制。实验方法1.收集95例组织病理学确诊的肝细胞癌患者癌及癌旁组织样本制备成组织芯片,免疫组化方法检测Sp2在癌组织及癌旁组织中的表达情况,并进一步与患者的临床病理特征及总生存期进行相关性分析。同时采用Western Blot方法检测4对新鲜肝癌组织及癌旁组织中Sp2表达水平。2.Western Blot方法检测三种肝癌细胞系Hep G2,Huh7及Hep3B中Sp2的表达情况,选定Sp2表达相对较高的Hep G2,Huh7细胞系进行后续实验,并在两种细胞系中采用瞬时转染技术分别转染小干扰RNA敲除Sp2。通过CCK8、克隆形成实验、划痕实验、transwell、流式技术等对细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡能力进行检测。3.免疫组化方法检测内质网应激标志性蛋白GRP78在上述95例原发性肝癌组织及邻近非肿瘤组织中的表达,同时采用Westernblot方法对4对新鲜肝癌/癌旁肝组织进行GRP78表达情况的检测。分析内质网应激组(GRP78高表达组)与非内质网应激组(GRP78低表达组)组别之间Sp2表达差异。瞬时转染技术敲除Sp2在肝癌细胞中表达,并使用Western Blot方法检测GRP78及内质网应激相关通路蛋白ATF6,PERK,IRE1α的表达变化。4.免疫共沉淀-高通量测序(Ch IP-seq)与肝癌细胞转录组测序的结果进行联合分析预测其可能靶基因。采用免疫组化方法检测可能靶基因TRIB3在上述95例原发性肝癌组织及癌旁组织中的表达,进一步分析TRIB3分别在Sp2高/低表达组别中的表达情况。用小干扰RNA敲除Sp2,Western Blot方法检测Sp2干扰后TRIB3蛋白表达变化。同时,采用小发夹RNA干扰TRIB3蛋白,transwell方法检测肝癌细胞的迁徙及侵袭能力变化。结果1.免疫组化结果显示Sp2在54.7%(52/95)的肝癌组织样品中高表达,但在癌旁组织中明显低表达。临床病理分析表明,Sp2表达与患者年龄、性别、组织学分级无关,与肿瘤大小(P=0.041),淋巴结转移(P=0.032)、临床分期(P=0.011)呈正相关。生存分析提示SP2高表达的肝癌患者预后较差。Western Blot检测结果提示,与相对应的癌旁组织标本相比,肝癌组织标本中Sp2明显过表达。TCGA肝癌基因组图谱中配对的肝癌/癌旁组织数据集分析表明,Sp2在肝癌组织中表达明显高于正常肝组织。TCGA数据的Kaplan-Meier生存分析也显示Sp2的高表达与总生存时间较短呈正相关。2.在Hep G2及Huh7两种肝癌细胞系中行CCK8及克隆形成实验均显示,Sp2在肝癌细胞中的缺失抑制了细胞的增殖和集落的形成。划痕实验,Transwell迁徙实验及侵袭表明,抑制Sp2可以显著抑制肝癌细胞的迁徙及侵袭能力。另外,流式实验结果也显示,在肝癌细胞系中敲除Sp2也可显著增加细胞凋亡。3.免疫组化及Western Blot结果显示GRP78在肝癌组织中高表达,在癌旁组织中呈现低表达状态。且在95例肝癌组织标本中,我们发现Sp2在GRP78高表达的组别中表达更强。体外实验结果表明,Sp2的敲低可明显下调Grp78的表达。值得注意的是,ATF6的表达更为明显的降低。但是,PERK和IRE1α并没有被下调。4.免疫组化结果表明,相对于癌旁组织,TRIB3在肝癌组织中表达更高。卡方检验提示,TRIB3在GRP78及Sp2高表达组别中分别有更高的表达趋势。Western Blot结果显示,Sp2沉默可下调肝癌细胞中TRIB3的表达。Transwell实验表明,敲除TRIB3后,Hep G2及huh7两种细胞系的迁移和侵袭能力均受到抑制。结论1.SP2在肝癌中过表达且其表达与肝癌进展及不良预后相关。2.Sp2敲低可以抑制肝癌细胞增殖、迁徙、侵袭,并促进细胞凋亡。3.Sp2敲除下调内质网应激,尤其是ATF6信号通路的抑制。但是对于PERK和IRE1α并没有下调作用。4.转录因子Sp2可能调控TRIB3蛋白并增强其表达,通过ATF6信号通路反馈调控内质网应激生物学过程,通过促生存途径的激活从而发挥促癌作用。