【摘 要】
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口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的,是感染猪、牛、羊等偶蹄动物的重要疫病之一。目前口蹄疫的防控主要通过灭活疫苗来进行,但考虑到灭活疫苗在生产中的安全隐患,研制安全有效的亚单位疫苗是很有必要的。口蹄疫的结构蛋白中最主要的是VP1/VP2,这两个蛋白的结构中有可以引起机体产生中和抗体的抗原表位,免疫后能够产生中和抗体,因此,VP1/VP2是亚单位疫苗方向
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口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的,是感染猪、牛、羊等偶蹄动物的重要疫病之一。目前口蹄疫的防控主要通过灭活疫苗来进行,但考虑到灭活疫苗在生产中的安全隐患,研制安全有效的亚单位疫苗是很有必要的。口蹄疫的结构蛋白中最主要的是VP1/VP2,这两个蛋白的结构中有可以引起机体产生中和抗体的抗原表位,免疫后能够产生中和抗体,因此,VP1/VP2是亚单位疫苗方向研究的靶标。鉴于此,本试验开展了以下研究内容:1.FMDV VP1/VP2基因在杆状病毒表面展示技术中的表达将FMDV的主要免疫原性基因VP1/VP2、杆状病毒的GP64全长基因序列插入pFastBacHTB载体的pPH启动子下游,获得重组质粒pFBH-VP 1-GP64和pFBH-VP2-GP64。然后分别将质粒转化DH10Bac进行转座,蓝白斑筛选后获得重组杆粒rBacmid-VP 1-GP64和rBacmid-VP2-GP64。将杆粒转染得到重组杆状病毒rBac-VP1-GP64和rBac-VP2-GP64。病毒再大量感染Sf9细胞,收取重组蛋白,通过Western blot分析蛋白的大小,结果表明VP1/VP2在Sf9细胞中都得到了有效的表达,为后期动物实验的免疫原性分析奠定了基础。2.重组杆状病毒rBac-VP1-GP64和rBac-VP2-GP64的免疫效力研究将重组杆状病毒感染Sf9细胞,收集培养样品进行纯化和定量,以BALB/c小鼠和猪为试验动物模型进行免疫原性评价。首先将BALB/c小鼠随机分组,每组4只。皮下接种rBac-VP 1-GP64和rBac-VP2-GP64重组病毒,同时设置阴性对照。在0.14、28、42天分别收集免疫后小鼠血清样品进行ELISA和间接免疫荧光实验（IFA）检测抗体。ELISA结果表明与对照组相比免疫组抗体水平随着免疫的加强抗体水平不断升高并且在42天达到最高水平。IFA结果与ELISA结果一致。重组病毒免疫猪只的攻毒实验结果显示,对照组3天发病率为100%,免疫组在5天左右才出现发病,且有60%的猪达到10天以上未发病。结果表明重组病毒在免疫后的小鼠和猪只体内均产生了很好的免疫反应,并且对FMDV攻击提供部分保护。3.口蹄疫病毒VP1/VP2基因在杆状病毒表达系统中的可溶性表达的研究将FMDV的主要免疫原性基因VP1/VP2及麦芽糖结合蛋白（Maltose-binding protein,MBP）基因序列插入pFastBacHTB载体的pPH启动子下游,获得重组质粒pFBH-VP1-MBP和pFBH-VP2-MBP。随后转化DH10Bac进行转座,通过蓝白斑筛选后获得重组杆粒rBacmid-VP1-MBP和rBacmid-VP2-MBP。重组杆粒转染Sf9细胞得到重组杆状病毒rBac-VP1-MBP和rBac-VP2-MBP,将病毒大量感染Sf9细胞,收取培养上清进行纯化和分析,结果表明,重组蛋白在Sf9细胞中都以可溶性的形式大量表达,这为后期的免疫原性分析奠定了基础。4.重组蛋白rBac-VP1-MBP和rBac-VP2-MBP的免疫原性分析将重组杆状病毒大量感染Sf9细胞,收集蛋白进行纯化和定量,以BALB/c小鼠为动物模型进行免疫原性评价。首先将BALB/c小鼠随机分组,每组4只。每只皮下接种100μg rBac-VP 1-MBP/rBac-VP2-MBP重组蛋白,同时设置阴性对照。在0、14、28、42天分别收集免疫后小鼠血清样品检测特异性抗体水平。ELISA结果表明,与对照组相比,免疫组抗体水平随着免疫的加强不断升高,并且在42天达到最高水平。IFA结果与ELISA结果一致。以上结果表明重组蛋白在小鼠体内诱导产生了较好的免疫反应。以上研究结果为FMD亚单位疫苗的开发提供了实验材料,也为其防控和诊断提供了基础。
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