[研究目的]：应用纳米技术,构建抗CD20纳米抗体梳,研究其对非霍奇金淋巴瘤细胞的体内外抗肿瘤作用及相关作用机制,为临床上提高非霍奇金淋巴瘤靶向治疗效果和解决利妥昔单抗的耐药问题提供新的思路和方法。[研究方法]：应用纳米技术,用分子量为70kDa聚乙烯亚胺(PEI)载体将两种不同类型的CD20抗体(Ⅰ型抗体利妥昔单抗,Ⅱ型抗体托西莫单抗)进行交联,构建梳状的CD20抗体纳米团簇,我们将其命名为抗CD20纳米抗体梳,标记为PPRT (PEI-Polymer-Rituximab-Tositumomab)。随后用动态光散射仪(DLS)比较PPRT纳米抗体梳和游离单克隆抗体的粒径大小,原子力显微镜(AFM)观察PPRT纳米抗体梳的显微形态,SDS-PAGE验证抗体与PEI载体的成功连接。体外实验中,分离新鲜人血清和人外周血淋巴瘤细胞(PBMC)作为补体和效应细胞的来源,分别与淋巴瘤细胞及抗体孵育后,比较游离CD20抗体和PPRT纳米抗体梳体外诱导淋巴瘤细胞的补体依赖的细胞毒作用(Complement Dependent Cytotoxicity, CDC)、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(Antibody Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity, ADCC)。Annexin V&PI双染后,流式细胞术检测PPRT纳米抗体梳诱导靶细胞程序性死亡(Programmed Cell Death, PCD)的能力。溶酶体探针染色后,流式细胞术和激光共聚焦显微镜比较游离抗体和PPRT纳米抗体梳处理后,淋巴瘤细胞溶酶体变化及其内容物的释放。JC-1染色后,流式细胞术检测靶细胞线粒体膜电位的变化情况,并用免疫荧光技术染色后,激光共聚焦显微镜观察靶细胞内细胞色素C从线粒体的释放情况。用Invitrogen公司FAM Poly Caspases Assay Kit染色后,流式细胞术比较游离抗体和PPRT纳米抗体梳处理后,淋巴瘤细胞内Caspase激活情况,并用Western Blotting技术检钡PPRT处理后,淋巴瘤细胞内Caspase 9和Caspase 3的活化情况。使用光学显微镜观察并比较游离CD20抗体和PPRT纳米抗体梳处理后,淋巴瘤细胞的同源粘附情况。体内实验中,我们分别对ICR小鼠注射相同剂量的游离抗体和PPRT纳米抗体梳,并于不同时间点眼眶取血,ELISA检测其血液浓度,PK-software分析其药代动力学参数。在体内抗肿瘤实验研究中,我们分别构建非霍奇金淋巴瘤的血液学模型和皮下肿瘤模型,比较游离抗体和PPRT纳米抗体梳对荷瘤小鼠生存率以及皮下肿瘤负荷的影响。为了检测PPRT纳米抗体梳对耐药淋巴瘤细胞的杀伤作用,本研究在体外应用“梯度加药法”成功诱导非霍奇金淋巴瘤细胞的耐药,构建了两株对利妥昔单抗耐药的淋巴瘤细胞株(Raji-R和JeKo-1-R),随后分别按照上述研究方法,检测了PPRT纳米抗体梳对耐药淋巴瘤细胞株的体内和体外杀伤作用,并探讨其诱导耐药淋巴瘤细胞程序性死亡的主要机制。[研究结果]：本研究成功构建了抗CD20纳米抗体梳PPRT。动态光散射结果表明,游离抗CD20抗体的平均半径约为7nnm,而本研究构建的PPRT纳米抗体梳的平均半径约为170nm。 SDS-PAGE结果表明,PPRT纳米抗体梳拥有较大的分子量,这种较大分子量是抗体与载体成功连接的有力证据。随后我们用免疫荧光标记法对PPRT纳米抗体梳与CD20抗原的结合和解离能力进行了检测,流式细胞术结果表明,与游离抗体相比,PPRT纳米抗体梳对靶细胞表面的CD20的结合能力相当,而解离能力则大大下降,这是PPRT纳米抗体梳持久抗肿瘤效应的微观基础。体外实验结果表明,PPRT纳米抗体梳可以通过CDC、ADCC和诱导程序性死亡三条途径杀伤淋巴瘤细胞。随后我们探讨了PPRT纳米抗体梳诱导淋巴瘤细胞程序性死亡的机制,结果表明PPRT纳米抗体梳能够激活淋巴瘤细胞内两条独立的与程序性死亡相关的通路：(1)由于细胞膜上抗原抗体复合物的交联(“细胞内交联”)而激活的经典的Caspase通路；(2)由II型CD20抗体托西莫单抗引起的与溶酶体相关的信号通路。多通路的激活,是PPRT纳米抗体梳极强诱导程序性死亡能力的分子基础。此外,在研究中我们还发现,由于多个抗体同时连接在一个载体上,PPRT纳米抗体梳能够结合不同细胞上的CD20抗原,引起靶细胞的同源粘附,增强肿瘤细胞对程序性死亡的敏感性,这种“跨细胞交联”也是PPRT纳米抗体梳极强的诱导程序性死亡能力的重要因素之一。体内实验结果显示,与游离抗体相比,PPRT纳米抗体梳拥有更长的半衰期和更慢的血浆清除率,其在肿瘤组织内部的富集较游离抗体更加明显。与游离的抗体药物相比,PPRT纳米抗体梳能显著延长荷瘤小鼠的总体生存率(overall survival, OS)和中位生存时间(median survival time, MST),降低荷瘤小鼠的肿瘤负荷。更为重要的是,本研究所构建的PPRT纳米抗体梳对对利妥昔单抗耐药的淋巴瘤细胞仍然具有很好的杀伤效果。[研究结论]：本研究中,我们应用纳米技术将两种不同类型的CD20抗体用聚乙烯亚胺载体成功交联,构建了一种新型的抗CD20纳米抗体梳。我们构建的PPRT纳米抗体梳可以通过CDC、ADCC和诱导程序性死亡作用来杀伤淋巴瘤细胞,在体内和体外实验中显示出极强的抗淋巴瘤作用,且该纳米抗体梳对对利妥昔单抗耐药的淋巴瘤细胞仍然显示出很强的杀伤能力。所有的研究结果表明,本研究所构建的PPRT纳米抗体梳并非其组分的简单相加,具有较好的安全性和广阔的临床应用前景。