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保幼激素(juvenile hormone)通常被认为是发挥维持昆虫的幼虫状态的作用,但它还有另外一个重要的功能,即促进成虫生殖。相对于保幼激素在抑制昆虫变态中的研究,人们对保幼激素促进成虫生殖的分子机制还知之甚少。飞蝗(Locusta migratoria)是我国乃至世界范围的重要农业害虫,又因其卵黄生成、卵巢发育和卵母细胞成熟都由保幼激素调控,使它成为研究保幼激素调控昆虫生殖分子机制的一个理想模型。 昆虫的脂肪体类似于脊椎动物的肝脏和脂肪组织,是营养贮藏、能量代谢和蛋白质合成的中心器官。飞蝗的卵黄原蛋白(vitellogenin)等卵黄物质在脂肪体中合成,通过血淋巴和卵泡细胞间的通道运送到卵母细胞,是卵成熟的必要前提,并受保幼激素调控。在雌性飞蝗羽化12小时内,使用早熟素(ethoxyprecocene)点滴飞蝗头胸间膜抑制咽侧体活性,阻止第一个促性腺周期内的保幼激素合成;然后再通过保幼激素类似物(s-(+)-methoprene)处理72小时,恢复保幼激素的合成,从而获得保幼激素缺失和保幼激素诱导的个体。本论文选择保幼激素缺失和保幼激素诱导的脂肪体开展了iTRAQ蛋白质组和label-free磷酸化蛋白质组学分析,共识别了3573个蛋白质、343个磷酸化蛋白质和597个磷酸化位点。其中,受保幼激素诱导上调和下调表达的蛋白质分别为199个和129个,磷酸化蛋白分别为62个和52个。磷酸化蛋白质组学的数据还显示,有40.4%的磷酸化位点在保幼激素诱导下发生了变化。通过与本课题组利用RNA-seq测定的保幼激素缺失和保幼激素诱导脂肪体的差异基因表达谱比较,发现与mRNA表达水平同时上调或下调的蛋白质占总识别蛋白质数目的28.05%,蛋白质与磷酸化蛋白质变化趋势一致的有7个;蛋白质水平与磷酸化位点同时上调的有3个,二者均下调的有8个,变化趋势相反的有2个。对这些候选基因开展进一步研究,将在蛋白质和磷酸化水平上阐述保幼激素的分子作用机制,有助于揭示飞蝗大量繁殖的遗传机理。 RNA干扰(RNAi)已经广泛应用于研究昆虫的基因功能,但RNAi效率在不同昆虫以及昆虫不同组织中存在很大差异,其成因仍然不清楚。我们在研究中发现,注射dsRNA能够在飞蝗脂肪体、头、脑、腿等组织或器官中取得显著的干扰效率,但在飞蝗卵巢中的干扰效果则不明显。本论文的荧光标记实验结果显示,注射的dsRNA和siRNA能够大量进入飞蝗的脂肪体细胞,也能够透过卵小管的外膜,但不能进入卵泡细胞和卵母细胞。结合SID-1、Clathrin hc与目标基因的共干扰实验,表明促进卵黄原蛋白运输与吸收的卵泡细胞间通道和受体介导的内摄机制(receptor-mediated endocytosis)不作用于dsRNA的摄取。我们还观察到,注射的dsRNA2个小时后在飞蝗血淋巴中已被大量降解。上述结果表明,dsRNA不能有效进入卵泡细胞和卵母细胞以及在血淋巴中的迅速降解是在飞蝗卵巢中不能实现有效RNA干扰的主要原因。该研究为探寻RNA干扰组织差异的成因以及在RNA干扰不敏感的组织中实现基因沉默提供了新的线索。