花青素是一类水溶性天然色素,属类黄酮化合物,广泛存在于自然界植物中。花青素是一种抗氧化剂,可清除自由基损伤,增强血管弹性,改善循环系统,保护肝脏和眼睛,预防辐射与癌症。花青素结构单元为3,5,7-三羟基-2-苯基苯并吡喃。由于C6-C3-C6骨架上多个酚羟基的存在,易受温度、光照、pH、氧、抗坏血酸、酶、金属离子等影响,出现褪色、变色、沉淀等现象。这导致花青素稳定性较差,很大程度上限制了花青素的应用。目前开发花青素优质价廉的加工原料和提高花青素稳定性,成为花青素研究热点。为探究山葡萄花青素的基本组分,获得相对稳定的花青素产品,拓展花青素原料市场,本文优选具有代表性的山葡萄品种北冰红为原料,采用对花青素结构破坏最小且提取效果好的非热加工技术-高压脉冲电场提取山葡萄花青素。对山葡萄花青素进行纯化,利用半制备液相获得山葡萄花青素单体。采用超高压辅助有机酸对山葡萄花青素进行稳态化处理,提高山葡萄花青素光、热稳定性。稳态化处理使山葡萄花青素结构发生变化,针对其生理功能进行急性毒性及体内外抗氧化活性研究。试验结果如下:1.高压脉冲电场提取山葡萄花青素工艺参数确定。在优化的高压脉冲电场,超高压,超声波,加热振荡4种方法中,高压脉冲电场法和超高压法提取效率较高,属非热提取,对有效成分破坏小,处理时间短,处理量大,其中脉冲电场法的提取效果优于超高压法。高压脉冲电场提取山葡萄花青素的最佳工艺参数为:液料比8.5:1 w/w,电场强度15 kv/cm,脉冲数4,总花青素含量为163.15±2.54 mg/100g·FW。2.山葡萄花青素单体制备工艺参数确定。经D101大孔树脂纯化,获得总花青素含量≥30%的山葡萄花青素纯化样品。单体制备参数:Waters 2545制备型高效液相色谱,Waters 2489 UV/Vis检测器,SunFire Prep C18柱(10 mm×250 mm,5μm);检测波长530nm;柱温25℃;进样量2 mL;流速2 mL/min;流动相A-5%甲酸水溶液,B-甲醇;梯度洗脱条件0-5 min,8-10%B;5-50 min,10%B;50-55 min,10-15%B;55-60 min,15-20%B;60-80 min,20-25%B;80-100 min,25-35%B;100-105 min,35-70%B。获得花翠素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊-3-O-葡萄糖苷、锦葵-3,5-O-二葡萄糖苷、矮牵牛-3-O-葡萄糖苷、芍药-3-O-葡萄糖苷、锦葵-3-O-葡萄糖苷六种花色苷单体,各花色苷单体含量≥95%。3.供试山葡萄品种确定及北冰红山葡萄花青素结构鉴定。北冰红、公酿一号、双红、双优、左优红5种山葡萄总花青素含量在67.80-398.77 mg/100g·FW之间,种间差异显著。山葡萄的酸水解液中均含有飞燕草素,矢车菊素,矮牵牛素,芍药素,锦葵素5种花青素苷元,苷元含量差异显著。纯化后5种山葡萄花色苷种类差异较大,其中北冰红所含花色苷种类最多,且含量较丰富(166.65±4.63 mg/100g·FW),因此选择北冰红作为鉴定及花青素稳态化处理原料。通过紫外-可见光谱、红外光谱、高效液相、质谱、核磁光谱技术,鉴定北冰红中含有花翠素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊-3-O-葡萄糖苷、锦葵-3,5-O-二葡萄糖苷、矮牵牛-3-O-葡萄糖苷、芍药-3-O-葡萄糖苷、锦葵-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素、矮牵牛素、花翠素-3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖、芍药素、锦葵素、花翠素-3-O-(6-O-p-香豆酰)葡萄糖苷。其中多种山葡萄均富含的一种花色苷首次经核磁光谱分析,确定为锦葵-3,5-O-二葡萄糖苷,将前人研究推进了一步,为山葡萄花青素单体研究与应用奠定基础。4.超高压辅助有机酸键合花青素的稳态化工艺优化。通过优化试验,确定超高压辅助有机酸稳态化处理山葡萄花青素的最佳条件:0.7 mg/mL复合有机酸(阿魏酸:D-葡萄糖酸:咖啡酸:香草酸=1.5:2.5:2.5:0.5,w/w/w/w)与0.1 mg/mL花青素进行超高压处理,键合压力300 MPa,反应时间2 min,可达到最佳稳定效果。超高压处理花青素的吸光值A为0.781±0.005,增色率I为42.26%,比传统方法处理花青素的增色率提高了12%。5.超高压辅助有机酸键合花青素的稳态化效果研究。采用超高压辅助有机酸键合花青素的稳定效果较好,处理时间短,效率高,较比传统方法有更广泛的应用前景。其中,超高压辅助复合有机酸键合山葡萄花青素在日光下处理20 d后吸光值A为0.433±0.008,比未处理花青素的吸光值高出44%,复合有机酸处理的花青素20 d后保存率R为56.02%,比未处理山葡萄花青素的保存率高约10%;超高压辅助复合有机酸键合山葡萄花青素在100℃加热2 h后吸光值A为0.568±0.005,比未处理花青素的吸光值高出81%,复合有机酸处理的花青素2 h后保存率R为73.48%,比未处理山葡萄花青素的保存率高约13%。研究表明超高压辅助有机酸键合花青素在曝光和热暴露条件下有较好的颜色稳定性。6.超高压辅助有机酸键合花青素的结构分析。经紫外-可见光谱、液相色谱、红外光谱、质谱分析显示,超高压辅助复合有机酸处理的山葡萄花青素与未处理花青素对比,最大吸收波长发生位移△λmax=11,液相图谱有明显的新物质峰出现,红外光谱有新增特征峰,质谱新增离子峰:411,421,425,433,435,439,443,477,611,625,627,639,669。这些现象表明超高压在短时间内促进了山葡萄花青素与有机酸的分子间或分子内作用,或促进了氢键、疏水键的形成,使花青素得到适当修饰,从而提高了光、热稳定性。7.超高压辅助有机酸键合花青素的稳态化机理研究。根据结构分析结果,推断超高压辅助复合有机酸键合花青素的稳态化机理为:山葡萄花青素在超高压条件下与阿魏酸、咖啡酸、香草酸反应,经脱丙烯酸、脱羧或脱水后形成新的花色苷衍生物,这些新形成的花色苷衍生物不易受光、热等因素的影响,使山葡萄花青素处于稳定状态,这可能是山葡萄花青素提高稳定性的主要原因。超高压促进花青素短时间内形成稳定的花色苷衍生物,提高了山葡萄花青素光、热稳定性。本研究明确了文献中有机酸对花青素的保护机制。8.超高压辅助有机酸键合花青素的急性毒性及抗氧化活性评价。超高压辅助复合有机酸键合花青素在2000 mg/(kg.d)范围内急性经口毒性属无毒级。超高压辅助复合有机酸键合花青素具有较好的体外抗氧化活性。超高压辅助复合有机酸键合花青素在20μg/mL时对DPPH、ABTS自由基清除率>90%,比未处理山葡萄花青素和抗坏血酸(VC)均高2-3倍。小鼠体内抗氧化活性试验表明,超高压辅助复合有机酸键合花青素喂养的小鼠血清、肝脏,肾脏,心脏和脑组织中的T-SOD和GSH-Px活性明显高于模型组(p<0.01),MDA含量明显低于模型组(p<0.01),说明超高压辅助复合有机酸键合花青素具有较高的体内抗氧化活性,且比未处理花青素效果更好。