枯草芽胞杆菌作为一种公认的GRAS (Generally recognized as safe)菌株,被广泛用于动植物病害的生物防治、植物生长促进剂、益生菌、工业酶类的生产及异源蛋白的表达等诸多领域。而细胞自溶现象在枯草芽胞杆菌中普遍存在,是制约其产量提高的一个重要因素。从遗传的角度,枯草芽胞杆菌的基因组上主要有三类基因与细胞自溶密切相关,它们分别属于细胞自食因子、噬菌体类以及肽聚糖水解酶类。本研究中我们采用多基因失活方法,考察这些不同类型的自溶基因在枯草芽胞杆菌细胞自溶及生物量的变化中所扮演的角色,并期望借此来探寻一种能够有效抑制细胞自溶提高枯草芽胞杆菌产量的新策略。我们以易于遗传操作的枯草芽胞杆菌模式菌株168菌株为材料,从上述三类基因中选取了以下几个最可能与细胞自溶相关的基因：编码肽聚糖水解酶的基因lytC,原噬菌体PBSX中编码RNA聚合酶σ类似因子的xpf和编码原噬菌体skin中自溶酶片段的yqxG-yqxH-CwlA(本文简称yGIA),编码芽胞形成期的细胞自食因子的skfA和sdpC。使用枯草芽胞杆菌温敏型的整合载体pNNB194对168的自溶基因进行了单缺失及多重组合缺失,得到了一系列单缺失及多重缺失突变株。对不同突变株生物量的测定发现,在单缺失突变株中LM2(skfA)、LM3(lytC)、 IM5(sdpC)和LM1(xpf)的生物量都有了明显的提高,其中LM1(xpf)生物量的提高程度相对较小,而yGIA的缺失株LM4的生物量未受影响；进一步的多重缺失自溶基因,突变株的生物量在二重及三重缺失时达到最高,而更多基因的缺失对生物量没有明显影响。我们同时还通过加入NaN3的方法测定了突变株的自溶活性,发现单独缺失xpf或lytC能明显地抑制细胞自溶,单独缺失skfA或sdpC对细胞自溶没有明显影响,然而在缺失xpf或lytC的基础上再缺失skfA或sdpC能够更加有效地抑制细胞自溶,至四重缺失突变株LM2531时细胞自溶得到了最大程度的抑制(加入NaN3后4h野生型168裂解92%,而LM2531仅裂解15%)。综合以上两个方面,我们认为四重缺失突变株LM2531不仅具有较高的生物量,而且能够在最大程度上抑制细胞自溶,是本研究中提高枯草芽胞杆菌产量的最佳策略。我们还尝试使用突变株对多个蛋白进行异源表达。其中表达白细胞介素IL32未能取得成功,通过绿色荧光GFP-IL32融合表达与GFP单独表达的对比可以发现融合表达的绿色荧光蛋白荧光强度大幅下降,由此我们推测使用枯草芽胞杆菌表达IL32时可能存在目的蛋白的降解现象,而这可能也是导致其未能成功表达的原因。以枯草芽胞杆菌的表达载体pBE2为骨架,使用强启动子P43和trpA终止序列,我们分别构建了β半乳糖苷酶的胞内表达载体pBL和纳豆激酶的分泌表达载体pBNA,在枯草芽胞杆菌168及其自溶基因四重缺失突变株LM2531中成功实现了β半乳糖苷酶的胞内表达和纳豆激酶的分泌表达。对比重组蛋白的产量发现,LM2531胞内表达β半乳糖苷酶的产量为13741U/ml是168产量7991U/ml的1.72倍,而LM2531分泌表达纳豆激酶的产量5226IU/ml是168产量2028IU/ml的2.6倍。表明自溶基因缺失突变株的应用在抑制细胞自溶提高生物量的同时还能够有效地提高枯草芽胞杆菌重组蛋白的产量。