隶属于卵菌的疫霉属包含120多个物种,其中大多数为破坏性的植物病原菌。作为一个半活体营养型的病原卵菌,疫霉菌在侵染寄主过程中可以分泌一系列效应分子,包括RxLR类效应分子来干扰寄主的防御反应,从而促进病原菌在寄主中的定殖。大豆疫霉的基因组包含400多个编码RxLR效应分子的基因,本课题组前期研究发现效应分子可以通过精确转录调控和团队协作来抑制植物的免疫反应,但是这些效应分子如何通过与寄主植物免疫反应的调控因子相互作用,如何干扰植物的免疫目前所知甚少。本研究首先对具有抑制植物免疫反应能力的38个效应分子的亚细胞定位进行了分析,在此基础上对效应分子Avh262和Avh172抑制植物免疫反应的分子机制进行了研究,此外还对大豆-大豆疫霉亲和/非亲和互作过程中的大豆蛋白质组进行了分析。主要研究内容包括:一、大豆疫霉RxLR效应分子的亚细胞定位分析。本研究对大豆疫霉RxLR效应分子分析,发现共26个效应分子具有核定位信号。对其中8个具有核定位信号效应分子进行定位分析,发现均主要定位于细胞核中。本研究发现具有核定位信号的效应分子Avh52在细胞核中呈现不规则的形态,核定位信号对其特殊定位和促进侵染的能力是必需的。本研究对38个大豆疫霉毒性所必需和/或能抑制植物免疫的RxLR效应分子进行亚细胞定位分析,发现其中大多数RxLR效应分子定位于细胞核和细胞质中,效应分子Avh172、Avh262以及Avrld能在病原菌侵染过程中聚集在吸器周围,这说明了它们可以在吸器周围发挥毒性作用来抑制寄主的免疫反应。此外,本研究发现Avh262定位于植物细胞的微管中,这是首次发现定位于微管的效应分子。运用激光共聚焦显微镜进行观察,发现Avh262能向植物的微管中进行转移和聚集。二、效应分子Avh262通过稳定BiPs调节内质网压力从而促进病原菌的侵染。本研究发现保守的大豆疫霉效应分子Avh262在大豆疫霉侵染大豆早期上调表达。对疫霉的Avh262进行沉默后对大豆丧失了致病力。Avh262在大豆发状根和烟草中的过表达能够显著促进大豆疫霉或辣椒疫霉的侵染。为了探索Avh262抑制植物免疫的分子机制,通过烟草体内Co-IP和LC-MS/MS技术筛选到了Avh262的靶标蛋白Endoplasmic Reticulum(ER)-luminal Binding immunoglobulin Proteins(BiPs)。利用Co-IP和Pull down验证Avh262能够与大豆的四个GmBiPs以及烟草中的NbBiP5互作。此外Avh262能够与BiP在内质网上共定位。本研究发现过表达BiP时,会有部分BiP蛋白进行降解,而Avh262和蛋白酶抑制剂MG132能阻止BiP的降解,本研究证实Avh262能稳定BiP使其维持在较高的蛋白水平。同时Avh262中的Bips-bindingdomain不仅对其促进侵染的功能是必需的,在Avh262稳定BiP的过程中也是必不可少的。BiP在烟草和大豆发状根中过表达能够促进疫霉菌的侵染,而在烟草中沉默NbBiP5则会增强烟草对疫霉的抗性,这说明BiPs是一个植物抗疫霉的负调控因子。此外,本研究还发现大豆和烟草的BiPs和Avh262能够抑制BAX引起的细胞死亡。然而沉默了Avh262的大豆疫霉转化子在侵染大豆时无法稳定BiP并引起植物细胞死亡,这说明BiP能缓解侵染过程中由内质网压力引起的植物细胞死亡。通过该研究发现了病原菌效应分子抑制植物免疫反应的新机制:在侵染早期大豆疫霉可以分泌效应分子Avh262进入寄主细胞,通过稳定BiPs来缓解内质网压力诱导的细胞死亡,降低寄主对病原菌侵染的敏感度,从而促进疫霉菌的定殖。三、Avh172的功能分析和靶标筛选。我们将一个在侵染过程中高量表达的IE(Immediately-Early)类效应分子Avh172融合RFP后在大豆疫霉中过表达,发现Avh172-RFP可以在侵染的大豆细胞中聚集在侵染孔口和吸器周围。Avh172在烟草细胞中表达时定位于细胞核和细胞质中。当利用融合RFP的辣椒疫霉侵染时,Avh172能够聚集在辣椒疫霉的吸器和侵染点附近。来自不同生理小种菌株中的Avh172具有不同的定位,但是都能抑制效应分子引起的细胞死亡。Avh172C端的亮氨酸对其核仁定位和抑制效应分子引起细胞死亡的功能具有重要的作用。此外将Avh172在大豆发状根中进行表达,通过Co-IP和LC-MS/MS技术筛选到了4个候选的靶标蛋白。四、大豆疫霉与大豆亲和互作及非亲和互作过程中大豆蛋白质组学分析。本研究利用非亲和互作的Williams 82-P6497以及亲和互作的Williams 82-P7076作为实验材料,通过双向电泳技术进行大豆疫霉与大豆亲和互作及非亲和互作的大豆蛋白质组学研究。通过质谱分析,本研究共鉴定到了83个差异表达的蛋白。基于这83个防卫反应过程相关蛋白,本研究利用qRT-PCR实验补充完善大豆抗病信号途径中相关基因的表达模式。分析结果显示抗病植物中ROS迸发、SA途径以及异黄酮合成相关基因和蛋白是上调表达的,从而说明了在大豆疫霉侵染过程中,大豆的ROS、SA途径和异黄酮的合成起着至关重要的作用。本研究可以为今后大豆疫霉与大豆互作中抗病反应的分子机制的研究提供重要线索。