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原肌球蛋白受体激酶A(Tropomyosin receptor kinase A,TrkA)是一种膜受体,它通过配体神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)结合引起胞内酪氨酸残基自磷酸化,并激活包括MAPK/ERK,PI3K/AKT,PLCγ在内的多种信号通路,TrkA磷酸化的位点和特性控制着细胞增殖、分化、生长、凋亡等过程,且NGF/TrkA信号通路与许多人类疾病如阿尔兹海默症,慢性疼痛,炎症,癌症等的发生有关,因此,它是治疗很多疾病的新兴治疗靶点。但是TrkA下游通路错综复杂,又与胞内段的磷酸化位点及其组合密切相关,因而TrkA磷酸化作用至今尚不能完全得以阐明。解析TrkA信号通路的重要难点在于TrkA信号是一个高度动态的过程,目前的研究缺乏对TrkA不同位点磷酸化的分别控制方法。本论文中我们提出了一种光敏TrkA的设计方案,利用全新的分子光控技术,通过遗传密码子拓展技术(Genetic Code Expansion,GCE)结合定点诱变,在目的蛋白TrkA特定磷酸化位点引入可光控的非天然氨基酸(Unnatural Amino Acid,UAA),研究TrkA不同磷酸化位点的调控机理。我们以琥珀终止密码子(Amber codon)作为识别非天然氨基酸的密码子,通过将TrkA酪氨酸(Tyrosine,Tyr or Y)磷酸化位点突变成终止密码子,再引入相应的tRNA和蛋白合成酶(RS),借助两对工程化且特异的正交tRNA/RS系统抑制琥珀终止密码子的表达,分别在TrkA五个磷酸化位点(Y490,Y670,Y674,Y675,Y785)引入两种光敏酪氨酸类似物,即叠氮基苯丙氨酸(p-azido-L-phenylalanine,AzF)或“光笼”酪氨酸(Photo-caged tyrosine,ONB)。这两种UAAs分别提供不同的光化学反应机制,ONB作为“光控开关”能够控制激酶磷酸化状态,而AzF是潜在的光交联分子。我们的研究目的是利用光学操纵TrkA单个位点酪氨酸的磷酸化状态,并观察其下游信号通路的激活。本论文内容主要分为两大部分,第一部分内容是设计和摸索合适的光控方法,即论文第二章和第三章,主要有以下三点结论:1)首先我们在哺乳动物细胞HEK293T中,利用两种荧光报告系统EGFP-amber,EGFP-amber-mCherry测试tRNA/RS对的正交性,并在TrkA-Y490位点引入AzF,ONB,建立编码光敏UAAs的方法;2)通过蛋白质免疫印迹分析我们发现,HEK293T细胞可以用来特意反应外源TrkA激活的p-ERK活性;3)在三种细胞模型PC12,HEK293T,SH-SY5Y细胞中分别引入两种基因编码拓展系统,发现在TrkA五个磷酸化位点均能定点引入AzF,ONB,且没有发生错误的通读。HEK293T细胞由于较高的表达效率是表达外源TrkA-AzF,TrkA-ONB突变体蛋白的合适细胞模型,而SH-SY5Y细胞可作为我们测试光控光敏TrkA突变体的神经细胞模型。第二部分内容是光控光敏TrkA突变体对细胞下游特定信号通路和细胞分化调控的检测,即论文第四章,主要结论是:1)我们首先利用HEK293T细胞,在TrkA-Y490ONB中验证了光控制激活ERK通路的可行性。Y490位点的磷酸化激活MAPK/ERK途径,且与细胞的增殖和分化有关,这在之前己有报道。其次,在其他磷酸化位点(Y670,Y674,Y675,Y785),尤其是功能尚不明确的激酶活性区三个位点(Y670,Y674,Y675),通过紫外光控TrkA-AzF,TrkA-ONB突变体,我们也检测到激活下游MAPK/ERK信号通路效应;有趣的是,我们发现将AzF,ONB引入到Y674,Y675位点,在不结合配体NGF的情况下光照可以直接激活MAPK/ERK通路,提供了利用光信号模拟NGF激活下游特定信号通路的光控模型。我们的结果表明除了两个主要的位点Y490,Y785外,激酶回路中的三个位点在MAPK/ERK通路的调控中也起到关键作用。2)利用内源TrkA干扰较小的SH-SY5Y细胞模型,我们将这种对光敏TrkA突变体ERK通路的检测(微观)与神经细胞分化(细胞表型)结合,发现光控可激活ERK途径的光敏TrkA突变体,对比光照前后其细胞分化程度较明显,在细胞表型上体现出良好的一致性。综上,我们的研究进一步扩展了遗传密码扩展技术在激酶受体中的应用,并揭示了依赖于TrkA位点的磷酸化对信号传递过程可能存在多态控制。论文研究初步建立了激酶受体光控磷酸化的实验模型。通过精确的光学控制,在单个磷酸化位点调控激酶受体的活性,达到定点光控磷酸化的效果。这种方法为激酶相关途径的综合分析和靶向治疗中筛选介入特定位点磷酸化途径的化合物奠定了基础。