嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus,A.caldus)是一种中度嗜酸嗜热、化能自养的硫氧化细菌,能够以还原性硫化物为能源进行生长,作为连续浸矿体系中的优势菌,广泛存在于浸矿体系及硫化矿酸性废水中,在生物冶金工业、资源环境保护等方面发挥着重要的作用。由于A.caldus具有生长缓慢、受环境影响大等局限性,对其硫氧化机制的研究不仅利于完善工程菌株的改造,还对实现工业应用有着重要的意义。在已报道的硫氧化模型中,A.caldus胞内亚硫酸代谢的研究还处于推测阶段缺乏实验证据,因此对亚硫酸盐以及亚硫化物代谢的研究具有重要理论价值及实际意义。本文以A.caldus中预测的亚硫酸盐氧化酶SIO(sulfite oxidase)和亚硫化物还原酶Srx(sulfiredoxin)为研究对象,综合利用生物信息学、分子遗传学和蛋白酶学的相关知识和技术,以确定SIO在胞内亚硫酸盐代谢中的功能,Srx在半胱氨酸亚磺酸的还原及无机硫化物到有机硫化物转化过程中的作用。本文主要通过以下几个方面开展研究工作:第一、利用生物信息学手段,对A.caldus MTH-04中sio、srx进行分析:通过对A calrdus MTH-04中目的基因orfl689、orfl690蛋白序列及结构域的分析,预测其分别编码亚硫酸盐氧化酶SIO和亚硫化物还原酶Srx。分别构建主要硫氧化菌株sio、srx基因簇以及系统发育树,展示基因簇排列规律,分析进化关系。结果表明,两者基因簇排列在A.caldus各菌株中基本一致,但在同属即嗜酸硫杆菌属及其它菌株中未发现较为明显的排列规律,蛋白序列相似性上,两者仅在同属菌株中相对较高,两者进化来源较为一致。第二、A.caldus MTH-04中sio、srx基因敲除株的构建:根据实验室前期建立的A.caldus基因无痕敲除技术,完成了A.caldus MTH-04中sio、srx基因的无痕敲除,成功构建了敲除株△Sio和Asrx,同时为了多角度验证目的基因功能,还构建了sio、srx的过表达菌株,分别记为WT(pJRD215-PtetH-sio)和 WT(pJRD215-PtetH-srx),以及对应的基因回补菌株△sio(pJRD215-PtetH-sio)和△srx(pJRD215-PtetH-srx),为下一步的基因功能探究奠定了基础。第三、A.caldus MTH-04 sio、srx基因敲除株功能的研究利用所构建的敲除株△sio、△srx,过表达工程菌株和回补菌株,在菌株生长特性、基因转录水平方面进行了探究。分别测定了目的菌株与野生型菌株在S0、K2S4O6为能源时的生长差异,结果表明,SIO缺失在高浓度硫粉(本文所设条件为添加1.2 gS0)影响菌株生长;而Srx对生长的影响体现在单质硫能量明显不足时,表现为敲除株△srx在硫粉缺乏时(0.4 gS0),生长较野生株更早进入稳定期,且稳定期生长量仅为野生株的2/3,srx过表达菌株稳定期生长量则显著高于野生菌;另外,在连四硫酸盐为唯一能源培养下,SIO的缺失和过表达、Srx的过表达对生长的影响表现为延迟期的增加,但稳定期生长量与野生株基本一致,而敲除株△srx对生长的影响则较小,推测SIO缺失导致该途径电子产生的中断,对菌体生长造成影响。通过RT-qPCR完成硫粉为能源培养下sio、srx基因敲除株和过表达菌株转录水平分析实验,研究发现,sio基因的敲除,造成了硫代谢主要基因表达的大幅上调,tetH上调幅度最大,其次是soxX-II、hdrC、sqr、sdo等,推测SIO的缺失导致了胞内SO32-的积累以及电子获得的减少,需要通过加速其它代谢途径进行弥补;而SIO作为代谢末端酶,其过表达对菌体生长及代谢影响不大;srx基因的缺失在硫粉缺乏培养条件下,引起了细胞周质空间连四硫酸盐-硫代硫酸盐代谢途径以及Sox系统硫代谢基因的表达上调,胞内连四硫酸盐代谢途径下游的基因表达下调,未检测到sio的表达,说明Srx与连四硫酸盐或硫代硫酸盐代谢途径有关,且SIO与Srx在代谢功能上可能存在一定的联系。第四、A.caldus MTH-04中sio、srx基因的异源表达及纯化基于A.caldus MTH-04基因组,分别构建sio、srx基因表达载体,在Escherichia.coli BL21(DE3)中完成了目的基因的异源表达,并成功纯化出Srx蛋白,为后续各蛋白酶活的测定及酶学性质的分析提供了实验基础。本研究实现了对SIO、Srx的功能研究,探索了它们在硫代谢网络中的作用,进一步解析并完善了硫代谢系统。