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目的:热带爪蛙作为爪蟾属唯一的二倍体物种,对于功能基因组学和生物医学领域具有重要的研究价值。尽管基因敲除技术在热带爪蛙上的应用已经非常成熟,但一直以来缺乏有效的外源DNA片段靶向整合进基因组的方法,这已成为热带爪蛙相关研究的技术屏障。本论文通过采用靶向内含子策略,建立基于CRISPR/Cas9系统及donor载体优化技术,建立起基于非同源末端连接(nonhomologous end-joining,NHEJ)修复机制而可以有效地在热带爪蛙基因组特异性位点插入外源DNA片段的技术方法,从而为建立人类疾病模型提供了一条重要的技术途径,并且有希望推广到其他物种上的应用。方法:(1)以热带爪蛙心脏特异性表达的肌球蛋白重链(myosin heavy chain,Myh6)基因作为靶基因,针对该基因最后一个内含子设计5个gRNA位点,筛选出效率最高的切割位点。(2)构建donor 1和donor 2载体:扩增包含靶位点在内的一小段同源序列(bait),构建含有一个bait和两个bait的donor载体。(3)构建donor3和donor 4载体:扩增靶基因3’端非翻译区(untranslated regions,UTR)序列,替换(2)中载体上报告基因3’端的poly A序列。(4)利用显微注射技术,分别将donor载体和Cas9 mRNA、单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA)共注射至热带爪蛙G0期受精卵,并对各组别胚胎进行整合效率分析:(1)注射4-5天后在荧光体视显微镜下挑选出荧光表型的嵌合体蝌蚪(founder),并统计各组数量;(2)以每组3-5只founder基因组为模板,设计引物扩增整合位点处5’端和3’端接口(junction)DNA序列,并测序分析;(3)每组剩下的founder养至成蛙后做生殖传递分析。(5)采用同样的策略,在细胞水平进行整合效率分析:(1)以293 T细胞中广泛表达的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因作为靶基因,针对该基因最后一个内含子设计3个gRNA位点,采用p CMV-EGxx FP系统筛选出细胞内有效切割位点;(2)按照上述方案构建4个donor载体并转染细胞,探讨整合情况及和动物实验相比较。结果:(1)我们在靶基因最后一个内含子上成功的筛选到高效的Cas9切割位点,测序结果显示,其切割效率超过60%。(2)在注射后的四个实验组中都有检测到数量不等的有荧光表型的founder,平均整合效率在8%左右。(3)donor 1实验组(8%)要比donor 2实验组(3.8%)的整合效率高,donor 3实验组(11.7%)要比donor 4实验组(7.6%)的整合效率高,即单bait介导的整合效率要高于双bait介导的整合效率。(4)donor 3实验组要比donor 1实验组的整合效率高,donor 4实验组要比donor 2实验组的整合效率高,即包含3’UTR序列的donor组别比不包含的组别整合效率更高。(5)在缺乏sgRNA的两个对照组中,没有检测到包含心脏在内的任何绿色荧光表型的蝌蚪,即对于donor DNA的靶向整合,sgRNA是必不可少的。(6)对各组别founder基因组的5’junction和3’junction均有扩增出目的条带,并在进一步的测序结果当中得以证实。(7)在70个测序结果当中,除了2个5’junction的测序结果显示完美匹配之外,其它均有不同程度碱基插入或缺失(indels)。(8)按照同样的策略在细胞水平转染结果显示四个实验组和对照组均有不同程度的荧光,并且对照组的荧光亮度更强。结论:(1)基于CRISPR/Cas9系统在基因组和donor载体上共同切割策略所介导的靶向整合技术在热带爪蛙上的应用是可行且有效的。(2)采用靶向目的基因最后一个内含子策略,可以在不影响内源基因功能的情况下在基因组上完整插入外源蛋白编码框,并借助于内源性启动子或增强子驱动表达。(3)双bait的donor载体设计方案可以有效避免载体框架无关序列的整合,但整合效率有所降低。(4)靶基因3’UTR序列对插入基因组的外源基因的表达起到某种重要的调控作用,但具体调控机制有待进一步研究。(5)同样的策略在细胞水平上未检测到靶基因的有效修饰。