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背景:原发性肺癌目前是我国最常见的恶性肿瘤之一。国家癌症中心2017年发布的数据显示,位居发病率和死亡率首位的均为肺癌。同时,超过67.6%的新诊断肺癌病例处于Ⅲ期和Ⅳ期,经过手术等综合治疗的ⅠA期和Ⅰ B期非小细胞肺癌患者,5年生存率大约为60%-80%。而Ⅲ A,Ⅱ B和Ⅳ期的5年生存率分别仅为14%,5%和1%。早期发现肿瘤并根治性的手术治疗仍是目前最有可能治愈肺癌,提高五年生存率的治疗方式。分子影像学是利用现有的医学影像技术对活体内的生物过程在细胞和分子水平进行成像。它可以使在疾病发生、进展过程中扮演着重要职能的特殊分子事件可视化,从而应用于疾病的早期诊断、术中成像、药物研发、治疗反应的监测。荧光成像因为实时可视化的特点和高度的敏感性、特异性,目前已成为生物医学研究和临床工作中的重要工具。肿瘤靶向肽由于能与靶点高特异性结合并且具有良好的药代动力学特征和生物安全性,目前已成为分子影像学研究的热点。不同肿瘤生物学行为的标志性分子都是肿瘤分子影像学诊断中的潜在理想靶点。膜型基质金属蛋白酶-2(MT2-MMP)在肺癌中存在差异性的超量表达,参与了细胞外基质的降解,促进肿瘤细胞的上皮-间质转化,同时可能是肺癌新生与进展中的抗凋亡因子和血管新生诱导因子,是肺癌分子影像学诊断的潜在靶点。目前,尚没有特异性靶向MT2-MMP的多肽配体被发现。因此,本研究以MT2-MMP为靶点通过噬菌体展示肽库筛选技术筛选出MT2-MMP的特异性靶向多肽,通过ELISA、原子力显微镜、等温滴定量热等技术验证备选多肽的体外亲和力和特异性,并进一步筛选出优势多肽(MT2-AF5p)。对MT2-AF5p进行荧光标记,用于肺癌的体内/体外分子影像学成像实验,对后续特定靶点的肺癌靶向诊断多肽或药物载体的研发奠定基础。方法:1.以MT2-MMP表面特异性肽段为靶分子,经噬菌体展示肽库四轮严格的消减筛选,并通过筛选策略的不断优化,筛选出与靶分子特异性结合的噬菌体阳性克隆。2.噬菌体阳性克隆进行ELISA初筛,去除非特异性结合和假阳性噬菌体。3.阳性克隆进行DNA测序,比对出对应的多肽序列,评价有无共同基序。4.表达、纯化、复性MT2-MMP蛋白催化结构域,ELISA鉴定备选多肽对结构蛋白的靶向性。5.固相合成法合成备选多肽,用原子力显微镜评价备选多肽与靶分子的力谱曲线,并通过记录上百条力谱曲线统计解离力的大小评价亲和力,阻碍实验评价特异性。6.等温滴定量热技术进一步确定MT2-AF5p和靶分子肽及靶分子蛋白的结合力和特异性,选择靶向性最好的优势多肽。7.ONCOMINE数据库检索肺癌MT2-MMP临床标本中mRNA表达水平的微阵列数据,统计后评价表达差异性。8.免疫组化、Western Blot、免疫细胞化学分别检测MT2-MMP在肺癌组织和不同肺癌细胞系中的表达水平。9.FITC 和量子点分别标记 MT2-AF5p(FITC-MT2-AF5p、QD@MT2-AF5p),细胞成像评价多肽探针对MT2-MMP高表达肺癌细胞靶向性。10.细胞黏附实验评价不同浓度多肽对MT2-MMP高表达肺癌细胞系的结合力。11.MTT检测细胞存活率,评价FITC-MT2-AF5p、QD@MT2-AF5p对细胞增殖的影响。12.构建肺癌荷瘤小鼠,对QD@MT2-AF5p的肿瘤靶向性进行体内成像评价。结果:1.噬菌体展示技术获得一系列与靶分子特异性结合的阳性克隆。最后一轮的得率可以达到8.46×10-1。ELISA初筛获得16个备选多肽,共同基序可能为PPX。2.ELISA筛选出6个与MT2-MMP催化结构域蛋白高度亲和多肽,Kd值均在纳摩级。3.MT2-AF4p和MT2-AF5p经原子力显微镜检测是备选多肽中的优势多肽,与靶多肽的作用力最高频率分别出现在240 pN和275 pN,与靶蛋白作用力最高频率出现在225 pN和250pN。封阻实验证实分子间作用除了 MT2-AF6p,其它备选多肽均为特异性结合。4.等温滴定量热证实MT2-AF4p和MT2-AF5p与靶分子有良好的结合特异性和敏感性。MT2-AF4p 的 Ka 值为 4.19×104 ± 8.8×103,结合位点为 0.59。MT2-AF5p 的Ka值为5.36×104±5.52×103,结合位点为0.64。以上三种体外结合力实验均显示MT2-AF5p为最佳亲和多肽。5.验证实验证实MT2-MMP在肺癌组织和肺癌细胞系H1299、A549与癌旁正常组织和正常细胞相比存在差异性的高表达。6.荧光标记的细胞成像和细胞黏附实验表明MT2-AF5p可以特异性的结合高表达MT2-MMP肺癌细胞系,结合具有特异性。MTT和溶血实验证实荧光标记的MT2-AF5p无细胞毒性。小动物活体成像证实荧光标记的MT2-AF5p可用于MT2-MMP高表达肺癌的体内成像。结论:1.本研究通过噬菌体展示肽库筛选技术,并不断优化筛选策略,结合多种不同的鉴定技术筛选出MT2-MMP特异性亲和多肽MT2-AF5p(HHRLHSAPPPQA)。2.荧光标记的MT2-AF5p可以特异性结合MT2-MMP高表达肺癌细胞系和肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织。MT2-AF5p多肽探针无明显细胞毒性。3.以肺癌生物学进展中特异性标志分子为靶点的分子影像学多肽探针筛选策略,为肺癌的早期诊断、术中光学成像、疗效评估开辟了新途径,具有重要的应用前景。