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前言EGFRvⅢ蛋白是EGFR蛋白最为常见的一种变构形式,其在多种肿瘤组织中尤其是人脑恶性胶质瘤组织中有所表达,但在人体正常组织中却无表达。EGFRvⅢ这种变构蛋白是由下常EGFR基因中的第1与第8外显子直接接合,在连接处形成新的甘氨酸而形成。正常EGFR基因的第2-7外显子缺失使得正常EGFR蛋白的细胞外功能域部分的267个氨基酸缺失而形成EGFRvⅢ蛋白。这种变构的EGFR蛋白在肿瘤组织中不需与EGFR相应配体相结合就能够被持续的激活,进而进一步促进肿瘤组织的发生发展。一方面,EGFRvⅢ蛋白只在肿瘤组织中表达而不存在于正常组织中；另一方面,产生EGFRvⅢ蛋白的细胞,其在增殖、侵袭及血管发生等方面均表现出了各种调节失控进而促进肿瘤发生发展的作用。因此,EGFRvⅢ蛋白是肿瘤的免疫治疗中是备受关注的抗原靶点之一。在人多形性恶性胶质瘤中,EGFRvIII蛋白能够促进肿瘤细胞的增殖与侵袭,其这种促进肿瘤发生发展的作用可能与转化生长因子β2 (TGF-β2)及白介素10(IL-10)的表达有关。材料与方法1、肿瘤样本的收集所有GBM肿瘤患者样本均由中国医科大学附属第一医院神经外科提供,经患者知情同意后,手术中获取。所有肿瘤样本均病理诊断为Ⅳ级恶性胶质瘤。肿瘤样本获取后,存放于-80℃深低温冰箱里,备用。2、总RNA的提取及RT-PCR使用Takara RNAiso Reagent试剂按照说明书,提取肿瘤样本总RNA。经分光光度计检测,OD260/OD280> 1.8并且经琼脂糖电泳无明显降解的RNA样本,用于RT-PCR及realtime RT-PCR实验。提取总RNA500ng,使用TaKaRa RNA PCR Kit试剂盒,按照说明书进行RT-PCR反应。EGFRvⅢ特异性引物：5’-GCGAGTCGGGCTCTGGA-3’5’-TTCACCAATACCTATTCCGTTACAC-3’。样本变性94℃2分钟,PCR扩增94℃30秒,55℃30秒,72℃1分钟；30个循环。RT-PCR产物,包括171bp (EGFRvⅢ)和972bp(WT-EGFR),于2%琼脂糖凝胶电泳。PCR产物进一步测序验证。3、免疫组化标本经福尔马林固定,石蜡包埋,5um切片。切片常规脱蜡至水,抗原修复。Hydrogen Peroxide Block中孵育30min。滴加适当浓度鼠抗人单克隆抗体DH8.3,4℃过夜,滴加酶标二抗,DAB显色。4、细胞培养人恶性胶质瘤细胞系U87.MG培养于高糖DMEM培养基+10%胎牛血清+100units/ml青霉素+100mg/ml链霉素的培养基中；稳定表达EGFRvⅢ的细胞系U87.MG.EGFRvⅢ由W.Cavenee and F.Furnari教授友情馈赠,培养于高糖DMEM培养基+10%胎牛血清+100units/ml青霉素+100mg/ml链霉素+200μg/mL G418培养基中,二种细胞系均置于37℃,5%CO2培养箱中培养。5、MTT分析对数增长期的U87.MG和U87.MG.EGFRvⅢ细胞以5×103细胞/孔加入96孔细胞培养板中,于37℃,5%CO2过夜培养。分别培养1、2、3、5、7天进行MTT检测,每2天更换一次培养基。终止培养,每孔加入DMSO溶液150ul,室温下震荡10min,选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上检测。6、侵袭力实验分析基质胶溶解,适当浓度包被transwell板中,5000个U87.MG和U87.MG.EGFRvⅢ细胞接种于上室1%血清培养基中,下室加入20%血清培养基,培养48小时后,固定染色并计数。7、Realtime RT-PCR检测将获得的总RNA,使用SYBR PrimeScript RT-PCR Two-Step kit试剂盒按照说明书进行realtime RT-PCR检测。PCR反应条件95℃10秒；95℃5秒,60℃20秒,40个循环。IL-10特异性引物：5’-GAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGA-3’5’-AGGCTTGGCAACCCAGGTAAC-3’。TGF-p2特异性引物：5’-GCTTTGGATGCGGCCTATTG-3’5’-CCAGCACAGAAGTTGGCATTGTA-3’。反应结束后分析Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线,用Comparative Delta-deltaCt法进行相对定量分析。8、Western blot鉴定使用能够同时识别EGFR蛋白与EGFRvⅢ蛋白的EGFR抗体进行western blot实验以鉴定细胞系U87.MG.EGFRvⅢ中EGFRvⅢ的稳定表达。细胞样本的蛋白提取,蛋白样本的制备,进行SDS-PAGE凝胶电泳,转膜,封闭,杂交,显色。结果共收集GBM肿瘤样本26例,经过RT-PCR筛选,EGFRvⅢ阳性表达样本5例,占总GBM患者的19.2%。RT-PCR产物经测序进一步验证。肿瘤样本进一步经过免疫组化鉴定证实存在EGFRvⅢ阳性表达。使用realtime RT-PCR的方法检测TGF-β2与IL-10在两组肿瘤样本中的表达水平显示：TGF-β2在两组肿瘤样本中,mRNA水平的表达量存在明显差异,EGFRvⅢ阳性组肿瘤样本其TGF-β2表达量明显高于EGFRvⅢ阴性组。而IL-10的表达量两组间无明显差异。对U87.MG.EGFRvⅢ细胞系使用westernblot鉴定结果显示,细胞系U87.MG.EGFRvⅢ能够稳定表达EGFRvⅢ基因。MTT检测U87.MG与U87.MG.EGFRvⅢ两种细胞系增殖能力结果显示,U87.MGEGFRvⅢ细胞系具有明显的增殖优势。侵袭力实验结果显示,U87.MG与U87.1VIGEGFRvⅢ两种细胞系两组细胞系间存在明显的侵袭力差异,U87.MG.EGFRvⅢ其侵袭性明显高于U87.MG细胞系且具有统计学意义。EGFRvⅢ基因能够增强胶质瘤细胞的增殖与侵袭能力。Real-time RT-PCR分别检测TGF-β2与IL-10在两组细胞系中的表达情况,结果显示U87.MG.EGFRvⅢ细胞系中其TGF-β2及IL-10的表达量均明显高于U87.MG细胞系中的表达量,具有统计学意义。结论通过实验,我们观察到了EGFRvⅢ基因对肿瘤细胞的增殖与侵袭的影响,进步我们检测了免疫抑制因子TGF-β2与IL-10的上调表达与EGFRvⅢ表达之间的关系,TGF-β2对人体的免疫监控,获得性免疫及自然免疫均具有明显影响。据此,我们得出结论1,EGFRvⅢ能够明显增强胶质瘤细胞的增殖能力及侵袭性；2,胶质瘤中EGFRvⅢ很可能通过某种信号通路通过上调TGF-β的表达,进而影响人体免疫系统产生对肿瘤的免疫抑制作用从而促进肿瘤的发生发展。这一发现对今后恶性胶质瘤的临床治疗提供了新的治疗策略和方向。