论文部分内容阅读
本研究旨在阐明传染性胃肠炎病毒(TGEV)对小肠上皮细胞炎性调控的作用机制,探讨亮氨酸(Leu)是否可以缓解TGEV感染对小肠上皮细胞的炎症反应,揭示Leu在TGEV感染小肠上皮细胞产生炎症反应中的调控作用。试验以IPEC-J2细胞为体外研究模型,分为三个试验。试验一考察TGEV感染IPEC-J2细胞对细胞增殖的影响,构建TGEV感染IPEC-J2细胞模型。为了探究TGEV对细胞增殖、凋亡和自噬的影响,将TGEV(MOI=5)与IPEC-J2细胞共同培养不同时间(1h、3h、6h、12h、24h、36h)。结果表明:(1)随着感染时间的延长,TGEV复制不断增加,TGEV感染IPEC-J2细胞24-36h,病毒复制达到高峰期。(2)TGEV感染IPEC-J2细胞36h显著抑制细胞增殖(P<0.01),促进细胞凋亡和自噬(P<0.01)。(3)TGEV感染IPEC-J2细胞36h能够提高NF-κB磷酸化水平(P<0.05),降低mTOR磷酸化水平(P<0.05)。试验二考察TGEV感染IPEC-J2细胞对炎性反应的调控机制。为了探究mTOR在炎性调控中的作用,TGEV(MOI=5)与10nM mTOR抑制剂(Rapamycin)或10μM mTOR激活剂(MHY1485)共同作用于IPEC-J2细胞培养36h。同时通过构建TGEV编码蛋白IPEC-J2稳定细胞株,筛选抑制mTOR的TGEV编码蛋白,考察TGEV编码蛋白与mTOR之间的关系。结果表明:(1)TGEV(MOI=5)感染IPEC-J2细胞36h时能够提高TLR2、TLR3、TLR9、RIG-I和MDA5的mRNA水平(P<0.01),激活NF-κB(P<0.01),诱导细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-β及IFN-λ的产生(P<0.01),显著抑制IFN-α的mRNA表达(P<0.05)。(2)在TGEV(MOI=5)感染早期,mTOR抑制后下调TLR2、TLR3、RIG-I和MDA5的mRNA表达水平(P<0.01),降低NF-κB活性,进而降低TNF-α、IL-6和IL-8的转录(P<0.01),在感染早期降低TGEV复制(P<0.01)。mTOR激活后上调RIG-I和MDA5表达(P<0.01),提高IFN-λ的mRNA表达水平(P<0.01),降低NF-κB和IL-8的mRNA表达水平(P<0.01),抑制TGEV的复制(P<0.01)。(3)TGEV的编码蛋白NSP4、NSP10、NSP12、ORF3a、S、ORF7显著抑制mTOR磷酸化水平(P<0.05)。(4)NF-κB抑制后,促进mTOR的转录水平(P<0.01),抑制TGEV的mRNA表达(P<0.01)。试验三考察亮氨酸缓解TGEV诱导炎症反应的作用机制。将TGEV(MOI=5)与不同剂量亮氨酸(5mM、10mM)共同作用于IPEC-J2细胞培养36h。结果表明:(1)10mM亮氨酸激活mTOR信号通路,抑制TGEV复制与细胞自噬(P<0.05)。(2)亮氨酸下调TLR2表达(P<0.01),抑制NF-κB活性(P<0.01),进一步降低TNF-α(P<0.05)和提高IL-10(P<0.05)的mRNA表达水平,从而缓解TGEV造成的炎性反应。综上可知:TGEV在IPEC-J2细胞中复制的高峰期为24-36h。TGEV通过TLRs(TLR2、TLR3、TLR9)和RLRs(RIG-I、MDA5)信号通路促进NF-κB磷酸化,调控炎性因子表达,此反应依赖于mTOR。通过添加亮氨酸能够激活mTOR活性,抑制NF-κB磷酸化水平,进而抑制促炎细胞因子TNF-α和促进抗炎细胞因子IL-10的表达,最终抑制TGEV复制,降低炎症反应,促进细胞增殖。