恶性肿瘤发展迅速、预后不良,严重威胁人类的生命健康。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)作为最常见的消化系统恶性肿瘤之一,其在全球的发病率排第五位,病死率高居第二位;我国是肝病大国,肝癌在我国的发病率排第四位,病死率排第二位,每年肝癌新发病例数超过全球总数的50%,严重威胁着我国人民的生命健康。肝细胞癌发病隐匿,进展迅速,复发率高,预后不良,肝癌患者1年总体生存率不到50%,5年总体生存率不到10%。究其原因是学界对于肝细胞癌发生机制的认识尚不清楚,因此加强对肝癌发生发展分子机制的研究对于革新肝癌的临床治疗策略,延长患者预后具有重要现实意义。近些年来,越来越多的研究表明表观遗传学调控紊乱在肿瘤的发生发展中至关重要。泛素化修饰作为一种重要的翻译后表观遗传学修饰,参与众多细胞生物学进程,其失调能促进多种恶性肿瘤的发生发展。环指蛋白14(ring finger protein 14,RNF14),作为一种RBR(RING-between-RING)类E3泛素连接酶,具有RING指结构域,能够引起自身或特异性底物的泛素化降解,在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。有文献报道,RNF14能够促进Barrett食管向食管腺癌进展;RNF14可以与TCF/LEF形成转录复合物,共结合于靶分子的启动子区域,稳定β-catenin的募集,从而正向调节结肠癌细胞中Wnt信号的传导,对结肠癌细胞的存活十分重要;另有研究报道,RNF14能够促进肿瘤细胞周期从G1期向S期的进展,促进DNA的复制与合成,调控肿瘤细胞的增殖能力;此外,RNF14的表达在前列腺癌及乳腺癌的发生发展中也发挥着重要作用。但RNF14在肝细胞癌的发生发展中所发挥的作用尚不清楚;调控机制上,尚未有研究表明RNF14可以通过其E3泛素连接酶依赖性的方式参与肝癌恶性生物学行为的调控。肝细胞核因子家族(hepatocyte nuclear factors,HNFs)在正常肝脏中优势表达,维持多种肝脏特异性基因的表达稳态,对肝脏发育、肝细胞分化及再生至关重要。该家族的主要成员包括HNF1、HNF3、HNF4等。HNF1α作为该家族的一员,与肝癌的发生密切相关。有研究报道HNF1α能够在体内体外实验中抑制肝癌细胞的增殖能力,提示HNF1α是肝细胞癌的抑癌因子。分子机制上,HNF1α蛋白稳定性较差,半衰期仅为4-6小时,提示其可能受泛素-蛋白酶体系统调控。但目前对于HNF1α的降解方式,以及其是否受泛素化调控尚不明确。通过分析uniprot蛋白数据库(http://www.uniprot.org/),发现HNF1α与RNF14之间存在相互结合,提示RNF14可能是HNF1α的E3泛素连接酶。有鉴于此,本文着重阐述了环指蛋白RNF14对肝癌细胞增殖与迁移侵袭的相关调控作用,以及RNF14识别并结合HNF1α,促进其降解的相关机制。对于进一步阐明肝癌发生发展的分子机制,改善肝癌临床治疗效果具有一定的价值。研究内容与方法:1.RNF14在肝癌发生发展中的调控作用本部分研究通过数据库分析、免疫印迹(Western blot)实验比较肝癌组织与癌旁组织、正常人肝细胞与肝癌细胞中RNF14的表达差异;通过Transwell迁移与侵袭实验研究RNF14对肝癌细胞迁移与侵袭能力的影响;通过CCK8增殖实验、克隆形成实验以及小鼠皮下成瘤实验研究RNF14对肝癌细胞增殖作用的影响。2.RNF14对HNF1α的调控及其机制本部分研究通过半衰期实验以及MG132阻断泛素蛋白酶体系统研究HNF1α可能存在的降解途径;通过免疫功沉淀实验研究RNF14与HNF1α之间是否存在相互结合;通过外源性过表达及敲除实验研究RNF14对HNF1α表达的影响;通过Ni-NTA Pull-down实验研究RNF14是否能够影响HNF1α的泛素化修饰水平。本研究主要结果为:1.RNF14在肝癌组织及肝癌细胞中高表达;(1)RNF14 mRNA在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织;(2)相比于正常人肝细胞,RNF14在肝癌细胞(Hep3B、HepG2、SMMC-7721、BEL-7404、Huh7、PLC)中的表达明显增加。2.RNF14能够促进肝癌细胞的增殖(1)RNF14能够增强肝癌细胞(Huh7、BEL-7404)的增殖能力;(2)RNF14能够增强肝癌细胞BEL-7404的克隆形成能力。(3)敲低RNF14能够显著抑制肝癌细胞BEL-7404在裸鼠皮下的成瘤能力。3.RNF14能够促进肝癌细胞的迁移与侵袭(1)RNF14能够促进肝癌细胞(Huh7、BEL-7404)的迁移能力;(2)RNF14能够促进肝癌细胞(Huh7、BEL-7404)的侵袭能力。4.HNF1α存在泛素-蛋白酶体降解途径(1)HNF1α蛋白半衰期较短,为4-6小时;(2)HNF1α受泛素-蛋白酶体系统调控。5.RNF14可能通过泛素-蛋白酶体途径降解HNF1α(1)免疫共沉淀实验证明HNF1α与RNF14之间存在相互结合;(2)过表达RNF14能够抑制HNF1α的表达;(3)下调RNF14能够促进HNF1α的表达;(4)RNF14能够上调HNF1α的泛素化水平。本研究的主要结论为:(1)RNF14在肝癌组织及肝癌细胞中高表达,且能够促进肝癌细胞的增值、迁移及侵袭能力;(2)RNF14能够识别并结合肝癌的抑癌因子HNF1α,并能够下调HNF1α的表达,提示RNF14可能通过下调HNF1α而发挥其促癌作用;(3)HNF1α存在泛素-蛋白酶体降解途径,且RNF14能够上调HNF1α的泛素化水平,提示HNF1α可能是RNF14的泛素化底物,RNF14可能通过泛素化降解HNF1α而发挥其促癌作用。本研究发现RNF14能够促进肝癌细胞的增殖与迁移侵袭,提示HNF1α可能是RNF14的泛素化底物,并且RNF14可能通过泛素化降解HNF1α而促进肝癌细胞的增殖与迁移侵袭。深入研究RNF14对HNF1α具体的泛素化调控机制,为探索肝癌发生的分子机制提供新的方向和研究思路,为肝癌患者的治疗提供新的表观靶向治疗选择与方向。