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研究背景:内皮损伤是动脉粥样硬化早期进程中重要的病理生理变化。气体信号分子NO(nitric oxide,一氧化氮)能够通过对蛋白质进行巯基亚硝基化修饰来发挥功能。Hsp90(heat shock protein 90,热休克蛋白90)通过自身构象改变参与多种细胞生物学事件。在细胞中,Hsp90与共分子伴侣(co-chaperone)以及“客户蛋白”三者形成复合体,使得“客户蛋白”完成正确的折叠,最终通过不同的途径发挥功能。已有研究表明,Hsp90的巯基亚硝基化修饰能够抑制其ATP酶活性,但其在内皮损伤中的作用及机制尚不明确。研究目的:本研究旨在探究Hsp90的巯基亚硝基化修饰在血管内皮损伤中发挥的作用及其机制。研究方法和结果:利用生物素转换法(biotin-switch)结合液相二级质谱(LC-MS/MS)技术发现Hsp90的半胱氨酸519位点(Cys519)可以发生巯基亚硝基化修饰。接着,在EA.hy926内皮细胞株上给予oxLDL(oxidized low density lipoprotein,氧化低密度脂蛋白)处理,通过生物素转换法(biotin-switch)结合免疫印迹(western blot)技术检测内皮细胞中的Hsp90巯基亚硝基化修饰水平,发现给予oxLDL处理后Hsp90巯基亚硝基化修饰水平明显增加。进一步构建Hsp90野生型以及半胱氨酸519(Cys519)位点突变质粒,转染EA.hy926内皮细胞并给予oxLDL处理,biotin-switch结合western blot结果再次验证了Hsp90 Cys519位点发生了巯基亚硝基化修饰。机制研究发现,oxLDL能够促进内皮细胞中iNOS(inducible nitric oxide synthase,诱导型一氧化氮合酶)的表达,使用iNOS特异性抑制剂1400W抑制iNOS活性能够抑制由oxLDL引起的Hsp90的巯基亚硝基化修饰。同时,免疫荧光结果显示,在oxLDL处理的内皮细胞中,Hsp90与AHA1(Activator of Hsp90 ATPase-1,Hsp90 ATP酶激活因子1)的共定位减少,而与Cdc37(cell division cycle 37,细胞分裂周期蛋白)共定位增加;Cys519位点突变后再给予oxLDL处理,Hsp90与AHA1的共定位不再减少,与Cdc37共定位不再增加。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-Ip)和western-blot结果显示,oxLDL明显降低内皮细胞中Hsp90与AHA1的结合,增加Hsp90与Cdc37的结合。同时,降低eNOS(endothelial nitric oxide synthase,内皮型一氧化氮合酶)Ser1177位点的磷酸化水平,减少NO的产生,而增加NF-κB的磷酸化水平,增加ICAM1(intercellular cell adhesion molecule-1,细胞间黏附分子-1)、VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1,血管细胞黏附分子-1)的表达。与野生型相比,Cys519位点突变后再给与oxLDL处理,可以逆转上述变化。将转染了Hsp90野生型以及Cys519位点突变质粒的EA.hy926内皮细胞与用Dil染色的THP-1细胞共培养,给或不给oxLDL处理,通过荧光倒置显微镜观察单核细胞与内皮细胞黏附情况,通过transwell小室检测单核细胞跨内皮迁移能力。结果表明,与野生型相比,转染Hsp90 Cys519位点突变质粒后能够显著逆转oxLDL引起的单核细胞与内皮细胞黏附增加以及单核细胞跨内皮细胞迁移的增加。结论:在内皮细胞中,oxLDL刺激通过上调iNOS促进Hsp90的Cys519位点发生巯基亚硝基化修饰。Hsp90的巯基亚硝基化修饰参与了oxLDL引起的内皮细胞损伤:一方面减少了Hsp90与AHA1的结合抑制eNOS的磷酸化和NO的产生;另一方面增加了Hsp90与Cdc37的结合促进了NF-κB的活化和内皮细胞对炎症细胞的募集。