山核桃Aux/IAA和ARF家族蛋白互作关系鉴定及其参与嫁接成活的作用初探

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山核桃(Carya cathayensis Sarg.)是我国特有的优质干果和木本油料树种,产业化过程中面临树体高大、抗性差、良种化程度低等问题。嫁接是解决山核桃产业化过程中突出问题的有效途径。揭示山核桃嫁接成活的机制,可为山核桃产业的转型升级提供理论和实践参考。前期研究发现生长素在山核桃嫁接成活过程中发挥着重要调控作用。在生长素信号通路中,Aux/IAA(auxin/indole-3-acetic acid)和ARF(auxin response factor)家族蛋白通过相互作用协同调控生长素响应基因的表达。然而,山核桃Aux/IAA与ARF蛋白家族成员具有怎样的互作关系,它们是否参与对嫁接成活的调控尚未见报道。本文克隆了山核桃ARF家族基因(CcARFs)并分析了其序列特征;通过酵母双杂交技术(Yeast Two-hybrid System,Y2H)及双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescent Complimentary,Bi FC)初步鉴定了CcARFs与CcIAAs蛋白家族的互作关系;基于转录组测序及荧光定量PCR技术(q RT-PCR)鉴定了嫁接相关的CcARFs和CcIAAs基因,并讨论了其蛋白水平互作关系。主要研究结果如下:(1)克隆获得25个CcARFs全长CDS序列,其编码蛋白含394~1123个氨基酸,外显子数量为1~15。CcARFs蛋白为亲水性不稳定蛋白,与薄壳山核桃(Carya illinoinensis)中的同源蛋白有更近的亲缘关系。CcARFs家族基因启动子上存在多个与激素相关的顺式作用元件。(2)亚细胞定位结果表明,CcARFs与CcIAAs蛋白大部分定位于细胞核;但CcARF19a、CcARF19b定位于细胞质,CcARF7a、CcIAA16、CcIAA28定位于细胞核和细胞膜。(3)22个诱饵蛋白CcIAAs-BD中的7个存在自激活。对无自激活的15个CcIAAs与25个CcARFs进行基于Y2H技术的互作分析,结果显示113个CcARFs-CcIAAs组合有明显的互作,14个CcARFs-CcIAAs组合互作较弱;在25个CcARFs中,CcARF2d、CcARF4a、CcARF9b和CcARF16c与超过10个CcIAAs存在互作关系;在15个CcIAAs中,CcIAAx、CcIAA28、CcIAA29a、CcIAA29b、CcIAA16和CcIAA27b与超过10个CcARFs存在互作关系。利用Bi FC技术验证了部分CcARFs-CcIAAs组合的互作,发现与Y2H结果一致。(4)CcARFs和CcIAAs在嫁接过程中的表达量及表达变化趋势不同。5个CcARFs基因和5个CcIAAs基因被鉴定为嫁接过程中的差异表达基因,其中CcIAAs的表达量下调、CcARFs的表达量上调。在差异表达基因中,CcARF2d-CcIAA27a1、CcARF4aCcIAA27a1、CcARF4a-CcIAA4、CcARF6a-CcIAA27a1和CcARF16d-CcIAA4 5个组合存在蛋白互作关系。CcIAA27a1和CcARF6a主要在茎部表达、在嫁接过程中表达水平高、在蛋白水平相互作用,推测在山核桃嫁接成活中发挥重要调控作用。
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