论文部分内容阅读
目的肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)是最新发现的TNF超家族促炎细胞因子成员,具有多种生物学活性,在免疫炎症疾病中起着重要作用。最近的研究表明TWEAK可能在肾损伤的发病机制中发挥重要作用,TWEAK通过结合其靶受体成纤维细胞生长因子诱导分子-14(fibroblast growth factor-inducible 14,Fn14)诱导炎症反应、血管生成、系膜增生、过滤屏障损伤、肾纤维化等。关注TWEAK/Fn14信号介导的肾损伤可能有助于指导临床狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)的治疗。本研究探讨儿童系统性红斑狼疮合并狼疮性肾炎(childhood-onset systematic lupus erythematosis with lupus nephritis,LN cSLE)尿液中TWEAK的表达水平及其临床意义。观察重组人TWEAK(recombinant human tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,rhTWEAK)干预人胚肾细胞293(human embryonic kidney cells 293,HEK293)对自噬和凋亡的影响,研究TWEAK诱导的自噬和凋亡二者之间的关系,揭示TWEAK在LN cSLE发病过程中的可能机制。方法(1)酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测尿液TWEAK水平的实验:(1)研究对象:cSLE患儿(≤18岁)共33例,男3例,女30例,年龄3个月~18岁(中位数12岁),其中LN cSLE患儿共13例。aSLE患者(>18岁,且18岁后起病)共30例,男5例,女25例,年龄20岁~63岁(中位数34岁),其中LN aSLE患者共15例。(2)收集资料:包括年龄、性别、血常规、尿常规、dsDNA、血清C3、C4、24小时尿蛋白、系统性红斑狼疮疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)等临床资料及相关指标。(3)尿标本收集:收集受试者晨尿10ml,低温高速离心机离心15分钟,留取上清分装,-80℃冻存待测。(4)定量检测:按照ELISA试剂盒说明书步骤进行操作,绘制标准曲线,定量检测尿液TWEAK表达水平。(5)疾病活动度相关性分析:采用SPSS软件分析尿液TWEAK水平与临床指标如dsDNA、血清C3、C4、24小时尿蛋白、SLEDAI之间的相关性。(2)rhTWEAK对HEK293细胞自噬影响的实验:(1)细胞分组和药物干预:取指数生长期的HEK293细胞传代并培养48h,分别以时间梯度(0H、6H、12H、20H)和浓度梯度(0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)rhTWEAK干预各细胞组。(2)应用蛋白质免疫印迹(Western Blot)和细胞免疫荧光方法检测时间梯度rhTWEAK干预后自噬调控因子LC3B蛋白的表达和荧光强度。(3)应用Western Blot和细胞免疫荧光方法检测浓度梯度rhTWEAK干预后自噬调控因子LC3B蛋白的表达和荧光强度。(3)rhTWEAK对HEK293细胞凋亡影响的实验:(1)细胞分组和药物干预:同(2)(1)。(2)应用DPAI染色法基于细胞形态学鉴定凋亡。结果(1)尿液TWEAK水平ELISA检测结果显示(1)LN cSLE组尿液TWEAK水平(231.951±116.630)较non-LN cSLE组(32.396±26.761)、正常儿童对照组(31.713±21.900)明显升高,差异有统计学意义(P均<0.001);non-LN cSLE组尿液TWEAK水平(32.396±26.761)和正常儿童对照组(31.713±21.900)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)LN aSLE组尿液TWEAK水平(236.738±97.253)较non-LN aSLE组(39.893±17.955)明显升高,差异有统计学意义(P<0.001);而LN cSLE组尿液TWEAK水平(231.951±116.630)和LN aSLE组(236.738±97.253)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。(3)相关分析表明,LN cSLE组尿液TWEAK水平与SLEDAI、rSLEDAI分别呈直线正相关(r=0.65,P<0.05)、(r=0.92,P<0.001);与血清C3、血清C4分别呈直线负相关(r=-0.94,P<0.001)、(r=-0.85,P<0.001);与尿蛋白定量(r=0.64,P<0.001)呈直线正相关。(2)rhTWEAK对HEK293细胞自噬的影响Western Blot和细胞免疫荧光结果显示:(1)与0H 100ng/ml rhTWEAK空白组相比,6H、12H、20H 100ng/ml rhTWEAK实验组自噬调控因子LC3B表达水平明显增高(P分别<0.001、<0.001、<0.001),LC3B荧光强度也明显增高(P分别<0.001、<0.001、<0.001),并呈时间依赖性。(2)与0ng/ml rhTWEAK空白组相比,10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml rhTWEAK实验组自噬调控因子LC3B表达水平显著增高(P分别<0.001、<0.001、<0.001),LC3B荧光强度也显著增高(P分别<0.001、<0.001、<0.001),并呈剂量依赖性。(3)rhTWEAK对HEK293细胞凋亡影响DAPI染色法结果显示:(1)与0H100ng/ml rhTWEAK空白组相比,6H、12H、20H 100ng/ml rhTWEAK实验组细胞凋亡比例明显增多,并呈时间依赖性。(2)与0ng/ml rhTWEAK空白组相比,10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml rhTWEAK实验组细胞凋亡比例也明显增多,并呈剂量依赖性。结论(1)尿液TWEAK检测标本易收集、无创,与SLE肾损伤明显相关,其表达水平可以动态反映LN疾病活动度,是可靠的cSLE合并LN的理想生物标志物。(2)TWEAK通过促进HEK293细胞自噬和凋亡的发生,参与LN的发病机制。(3)尿液TWEAK在LN cSLE和LN aSLE之间表达无显著差异,无法区分LN cSLE和LN aSLE。