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猪呼吸道疾病综合征（Porcine Respiratory Disease Complex,PRDC)是引起呼吸系统症状的一类重要综合征的总称，近些年来，随着规模化养殖的迅速发展，临床上出现了一种以呼吸道症状为主症的猪病，给养猪业造成巨大损失。研究表明，猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)、猪链球菌(Streptococcus suis,SS)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)、猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multoc ida, Pm)是引起PRDC常见病原菌。迄今，安徽地区猪群中Mhp、SS、HPS和Pm的流行情况还不完全清楚，同时此四种病原菌引起的临床症状较为相似，故难以从临床症状上对其诊断，不利于准确快速鉴别诊断。鉴于此，在前期研究的基础上，本研究旨在建立同步检测Mhp、SS、HPS、Pm的四重PCR方法，为临床快速鉴别鉴定及其流行病学调查研究提供技术手段。为此，本研究开展了以下两方面的工作。首先，建立了检测Mhp的单一PCR方法并优化可以同步检测Mhp、SS、HPS、 Pm四种病原菌的复合PCR方法。根据Mhp P36基因序列，应用软件设计合成特异性引物。通过优化确定了检测Mhp单一PCR方法的最佳反应体系和反应条件。再通过序列分析、敏感性试验、特异性试验和重复性试验评估建立的单一PCR方法。在单一PCR的基础上，首先寻找能检测四种病原菌的相同退火温度，然后采用正交设计优化Taq DNA聚合酶、Mg2+、 dNTPs和引物，并对PCR发应时间和循环数进行摸索，确定了四重PCR方法的最佳反应体系和反应条件。然后，利用建立的四重PCR、单一PCR与常规细菌分离技术相结合的方法，对分别采自安徽地区临床疑似PRDC发病猪、临床发病非PRDC猪以及临床假定健康猪进行检测，并进行细菌分离。结果显示，总共分离细菌27株，其中SS18株， HPS4株，Pm6株，Mhp未做分离。四重PCR方法检测结果与单一PCR方法检测结果差异不显著(P>0.05)，且符合率为91.0％。安徽各地区猪场HPS存在较高带菌情况，SS存在较高感染，HPS与SS同时阳性率较高，为15.84%(35/221)，而四种同时阳性率为0%，且病原在分布上有区域差异性，不同生长阶段的猪群均可检出。综上所述，本研究建立的四重PCR方法可以在3h鉴别出Mhp、SS、HPS和Pm，且具有良好的特异性、灵敏性、稳定性和重复性，以及具有简便、快速与经济的优势，实验研究结果表明，所建立的四重PCR方法可直接用于临床PRDC四种病原菌的鉴定，而且为安徽地区开展PRDC流行病学调查提供了有效的技术手段。