大肠癌是一种易于复发和转移的恶性肿瘤，尤其是肝脏转移极易发生，严重威胁人类的健康。对于那些丧失了手术治疗时机的患者，其病变的范围和程度决定了其预后及生存时间，平均生存时间约为一年左右。由于目前尚无有效的治疗手段，基因治疗的研究已成为人们研究的一个热点，大肠癌的转移多发生于肝脏，靶器官比较明确，使之易于进行基因治疗的研究。在众多的免疫因子中，IFN-γ通过以下几个方面诱导机体产生抗肿瘤免疫，它可以激活机体的免疫细胞，如T淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞等杀死肿瘤细胞；可以诱导MHC Ⅰ类和Ⅱ类抗原及其他细胞表面抗原的表达，从而活化抗原递呈细胞的功能；它还可以抑制肿瘤细胞的增殖而发挥抗肿瘤作用。本实验利用IFN-γ基因修饰大肠癌细胞，通过细胞学和动物学实验，观察IFN-γ基因治疗肿瘤的作用，并初步探讨其作用机制。 一、IFN-γ真核表达载体的构建、基因的转染、表达 IFN-γ是一种具有免疫调节作用的干扰素，其基因位于人类第12对染色体，由大小约6kb左右的单一基因编码，含有4个外显子和3个内含子，在人类翻译成含166个氨基酸的序列，包含23个氨基酸信号片段。利用BamHI和EcoRI双酶切带有人IFN-γ基因的质粒pLXSN-IFN-γ，回收目的基因IFN-γ，经序列测定后与利用相同双酶切后的pBluescript质粒大片段相连，构建穿梭质粒pBluescript-IFN-γ，再利用HindⅢ和Xbal酶切pBluescript-IFN-γ，与利用相同酶切后的pcDNA-3质粒大片段相连，构建真核表达质粒载体pcDNA3-IFN-γ。酶切鉴定后，大量制备和纯化，以备转染。利用阳离子脂质体将IFN-γ基因转染进入生 南京医科大学硕士学位论文 长旺盛的 LOVO、SW62O、HCTll 6BG细胞内并利用 用PcR、RT－PCR对FN－Y基困的整合和表达进行鉴 定，结果表明 IFN－丫基因已成功的进入肿瘤细胞内并 实现表达。利用双抗体夹。GEL旧A法测定基困转染后 不同时间细胞培养上清中 ＊N－Y的活性。结果显示基 因转染后4，J、时细胞上清内gF可检测到F刚－Y活性，24 小时达到最大值，其活性持续6天仍未见明显下降。 不同的细胞株所分泌的 F－Y的量不同，显示了细胞 株之间生物学特性的差异。 二、IFN叫基固转染对肿瘤细胞的作用 主要是通过细胞学实验检测！FN叫基因转染后细胞 表面抗原的表达情况、对细胞的生长抑制、细胞周期的 影响情况，初步探讨F队丫基因转染后抗肿瘤作用的 机制。利用放射免疫法检测基因转染前后细胞分泌 CEA 的变化，分别收集基因转染后48，J、时的细胞培养上清， 利用相同培养条件下未进行基困转染的细胞培养上清作 对照，结果显示：经基因转染后，原来高表达C印的 细胞株（LOVO、HCTll 6BG）其上清中 C印含量增 加明显（p＜0刀1），而原来低表达甚至不表达＊EA的 细胞株（Hela、SW620）其上清CEA含量则无明显增 加（p＞0．05）。利用流式细胞仪对相同培养条件下基因 转染前后细胞表面Hu－DR的表达情况检测结果可以 看出：导入F－y基因后，各细胞株表面的 HLA－DR 的表达量明显增强（p＜0．01）。通附IFN－Y基因转染 前后肿瘤细胞的凋亡情况和细胞周期的变化显示：转染 IFN＊基因后促进了 LOVO细胞的凋亡（p＜0刀5L从基 因转染后不同时间细胞周期的分析结果看，转染D－ Y基因后细胞的S期比例随作用时间延长而呈逐渐降 低趋势，显示了基困转染后DNA的合成代谢受到抑制， 从而抑制了肿瘤细胞的增殖。 三、IFN叫基固体内应用的抗肿瘤作用 利用 BALBIC，1、鼠成瘤的 CT26结肠癌细账， 3 南京医科大学硕士学位论义 分别制备小鼠皮下转移瘤和腹腔转移瘤模型，肿瘤接种 8天后（皮下组瘤直径约为 3叶mm；腹腔组转移瘤＜3 个，平均直径约为0．5呕，无明显腹水），分别给予 AdFN－Y、AdLacZ、pcDNA31FN－c ILpofeCtAmine、 PBS注射治疗。携带下N－Y基因的重组缺陷型腺病毒 预先经扩增、纯化和滴度测定，腺病毒的注射量为 10Mulo．lmll只小鼠，一周后重复同样的注射一次。治 疗结束后第3天，开始检测小鼠的免疫功能指标、肿 瘤细胞及瘤体内浸润细胞的分析、瘤体大小的变化和小 鼠的存活情况。所有小鼠接种c丁26细胞后一周左右成 瘤，腹腔接种组接种后二周左右出现明显腹水和腹膜、 肝脏多发性转移瘤（臼个）。治疗组小