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背景和目的粘膜是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线,目前发现90%以上的人类传染病通过粘膜途径感染。粘膜免疫在机体免疫系统中占有重要的地位,它能够抵抗致病菌的入侵,对饮食和呼吸中的有害抗原,作出适当的免疫应答,同时对环境和食物中的无害抗原及共生菌,表现为免疫耐受。所以,如果能够控制粘膜感染,就可控制大部分传染病的发生。人体肠粘膜总面积为300m2,是机体内外环境交流的主要界面,是粘膜感染过程中的易发部位。肠道粘膜免疫系统由肠相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissue, GALT)组成,是机体免疫系统中最大最复杂的网络。具有严格的免疫反应机制和完善的免疫调控机制。派氏结(PP)、肠系膜淋巴结(MLN)及孤立淋巴滤泡是肠道黏膜免疫应答的诱导部位,负责起始肠道内的免疫应答；肠道黏膜上皮内淋巴细胞(IEL)及固有层(LP)内散在的淋巴细胞是肠道黏膜免疫应答的效应细胞。与系统免疫应答相比,粘膜免疫系统的一个显著的特点是产生分泌型IgA(secretory IgA, sIgA)。人类肠道每天能够分泌3g以上的sIgA。已知IgA占体内总免疫球蛋白75%以上,其中大部分是位于粘膜表面的sIgA。sIgA对保持肠道上皮的稳态起重要作用,它可与入侵的病原微生物结合,阻止其在粘膜上皮细胞表面的定植,并能中和致病菌产生的毒素和侵袭性酶类。此外,sIgA对由食物摄入和空气吸入的某些抗原物质具有免疫排斥作用,可封闭这些抗原,使其游离于粘膜表面不致进入机体,从而避免引起全身的免疫反应,减少局部过敏反应的发生。树突状细胞(DC)是功能最强的抗原提呈细胞,是固有免疫和适应性免疫的桥梁和纽带,其调节机体免疫应答的类型和强度。业已发现肠道DC有与脾脏、胸腺、腋窝淋巴结和腹股沟淋巴结来源的DC不同的特性,前者能产生RA,而后者不产生RA。肠黏膜DC产生的RA是粘膜免疫应答的一个关键性调节因素,RA能诱导T、B淋巴细胞表达肠黏膜归巢受体,从而赋予在肠相关淋巴组织中活化的T、B淋巴细胞经过淋巴细胞再循环后,重新归巢到肠黏膜的特性；RA参与B细胞IgA类别转换；RA还能影响肠黏膜Treg和Th17的分化,从而可能在炎症性肠病的发生和发展中发挥作用。但是肠黏膜DC产生RA的机制——即什么信号启动DC产生RA迄今尚未阐明。晚近有学者发现,皮肤和肺中的DC也能产生RA。值得注意的是：能产生RA的DC的组织来源与不产生RA的DC的组织来源相比,前者都与外界环境相通,存在大量的共生菌,而后者都处于无菌状态。所以我们推测,微生物的某些组成成分可能是DC产生RA的始动因素。本实验研究Toll样受体4和9(TLR4/9)的配体——LPS及CpG对骨髓来源DC合成RA能力的影响。方法1.DC细胞分组处理：培养的骨髓细胞系——DC2.4经PBS洗涤后重悬,以1×106cells/well接种于24孔板,经下列三种不同处理,在37℃、5%CO2条件下培养48h。1.1 LPS对DC产生RA影响的分组：①空白对照组,即DC组；②DC+LPS(10μg/ml)；③DC+LPS(1μg/ml);④DC+LPS(0.1μg/ml);⑤DC+LPS (0.01μg/ml);⑥DC+LPS(0.001μg/ml)。1.2 CpG对DC产生RA影响的分组：①空白对照组,即DC组；②DC+CpG(10μM);③DC+CpG(1μM);④DC+CpG(0.1μM);⑤DC+CpG(0.01μM);⑥DC+ CpG(0.001μM)。1.3 NF-KB阻断剂SN50对DC产生RA影响的分组：①空白对照组,即DC组;②DC+LPS(1μg/ml);③DC+LPS(1μg/ml)+SN50(18μM);④DC+CpG(1μM);⑤DC+CpG(1μM)+SN50(18μM)。2.实时荧光定量PCR测定处理后DC的RA代谢相关酶(ALDH1a-1,-2,-3及ADH-1,-4,-5)的表达。3.LPS或CpG处理细胞30和60分钟后,提取细胞浆和细胞核蛋白,Western blotting检测NF-KB蛋白表达。在之前培养体系中加入NF-κB蛋白阻断剂SN50,Western blotting检测阻断效应。4.DC和B细胞共培养：采用流式细胞术分选C57BL/6小鼠脾脏B细胞(5×105),与1μg/ml的LPS或1μM的CpG预处理48h的DC(1×105)共培养4天。以10种方式处理细胞(IL-5和IL-6浓度10ng/ml)：空白对照组,即B细胞组；B+DC2.4细胞组；B+LPS-DC组;B+LPS-DC+IL-5组;B+LPS-DC+IL-6组;B+LPS-DC+IL-5+IL-6组；B+CpG-DC组；B+CpG-DC+IL-5组;B+CpG-DC+IL-6组;B+CpG-DC+IL-5+IL-6组。5.收集共培养4天的细胞,流式细胞仪分析B细胞归巢受体α4β7和CCR9表达。6.B细胞趋化试验：收集与DC共培养后的B细胞,Transwell细胞迁移试验检测B细胞对趋化因子MadCAM-1和TECK的趋化活性。7.收集共培养4天的细胞培养上清,ELISA法检测上清中IgA浓度。8. ELISA检测不同浓度LPS或CpG处理48h的DC培养上清中IL-6和TGF-β1的浓度。9. Griess法检测不同浓度LPS或CpG处理48h的DC培养上清中NO浓度。结果1.LPS或CpG能诱导骨髓来源的DC表达Aldh1a2 mRNA。1μg/ml LPS处理DC48小时后,Aldh1a2 mRNA表达增高最为明显,增高近10倍,ADH4表达上调增高18倍。1μM CpG处理DC后Aldh1a2 mRNA表达提高12.45倍,Aldh1a1 mRNA表达有近10倍的提高,ADH4表达上调近12倍。但无论任一浓度的LPS或CpG处理后,DC Aldh1a3 mRNA都没有发现明显的改变。2.NF-κB信号通路在LPS或CpG诱导DC产生RA中发挥重要作用,用抑制剂SN50阻断后,NF-κB核转位被抑制,DC表达Aldh1a2 mRNA下降。SN50加入到LPS-DC (CpG-DC)体系30min后,NF-κB核转位即可被抑制。细胞核内NF-κB/Histone H3比由0.34(0.33)仅上升为0.46(0.48)；60min后阻断效应更加显著,核内NF-κB/Histone H3比0.44(0.47)。SN50使TLR-DC Aldhla2相对表达量增高幅度分别由10倍之多降为仅2倍。3.LPS-或CpG-DC增强B细胞肠黏膜归巢受体α4β7和CCR9的表达,其中上调CCR9较α4β7明显,CCR9平均荧光强度均提高了1倍之多。IL-5和/或IL-6增强α4β7表达,但不影响CCR9表达。4.LPS-或CpG-DC能增强B细胞对TECK的趋化活性,与对照组相比,分别提高了6.4和13.1个百分点。但LPS-或CpG-DC对B细胞对MadCAM-1的趋化活性影响较弱,仅分别提高2.5和6.25个百分点。5.LPS-或CpG-DC促进B细胞分泌IgA,培养上清中IgA浓度与对照组相比分别提高近4倍和6倍。但外加的IL-5和/或IL-6并没有进一步促进IgA的分泌。6.LPS或CpG增强DC产生IL-6,TGF-β和NO的能力。刺激物浓度在0.1-10区间内与细胞因子分泌成正相关,呈现剂量依赖性。10μg/ml LPS或10μM CpG刺激DC2.4后,其IL-6分泌量分别提高了1.3和1.5倍,TGF-β1分泌量分别增加了61%和70%。在10μg/ml LPS及10μM CpG时,NO分泌量达到最高,与对照组相比,分别提高了47%和84%。结论TLR配体能触发骨髓来源DC获得产生RA的能力,提示肠道微生物在DC产生RA中发挥关键作用。