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第一部分巨噬细胞TREM-2通过调控NADPH来源的ROS水平介导其杀菌防御作用研究目的:TREM-2（Triggering receptor expressed on myeloid cells-2,TREM-2）是主要表达在巨噬细胞表面的免疫球蛋白超家族分子受体,可以识别细菌的病原相关分子模式,在细菌的吞噬与清除中发挥重要作用。活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）是巨噬细胞杀灭细菌的重要机制之一。文献报道,TREM-2介导的巨噬细胞内细菌清除作用与ROS的产生密切相关,但ROS的确切细胞器来源及其具体作用尚未阐明。因此本部分研究将首先证实E.coli感染过程中TREM-2对巨噬细胞氧化应激的影响和NADPH来源的ROS在巨噬细胞免疫防御中的重要作用。研究方法:体外培养野生（WT）和Cybb-/-的骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow derived macrophages,BMDMs）,分别转染过表达TREM-2的腺病毒或对照的腺病毒,采用荧光标记的大肠杆菌感染观察TREM-2对上述两种基因型的巨噬细胞的吞噬功能的影响,采用庆大霉素保护实验观察两组细胞的杀菌效率,并进一步采用透射电子显微镜观察比较两种细胞细菌的吞噬清除情况。采用E.coli刺激过表达TREM-2的BMDMs和对照BMDMs,于0、1、2、3、6、9、12小时流式细胞术检测细胞内总ROS产生的情况。采用气管滴注大肠杆菌的方法在WT小鼠（6-8周、雄性）制备大肠杆菌肺炎模型,3小时后经气管回输过表达TREM-2或GFP的WT的BMDMs,或过表达TREM-2或GFP的Cybb-/-的BMDMs,观察小鼠72小时生存率,采用琼脂平板法检测肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）细菌负荷、HE染色法观察肺部病理改变、BCA法检测BALF中白蛋白渗出情况以评估肺血管通透性的改变,并采用酶联免疫吸附法检测BALF中IL-1β与TNF-α的水平。研究结果:在WT的BMDMs中,过表达TREM-2对E.coli的吞噬能力和杀菌效率均较对照组显著增强。透射电子显微镜观察发现与对照组相比,在E.coli感染早期（1小时）,过表达TREM-2的BMDMs胞内吞噬体形成增多,而在感染6小时后,吞噬体清除增加。经E.coli刺激后,过表达TREM-2的BMDMs胞内总的ROS的产生与对照组无明显差异。但在Cybb-/-的BMDMs中,过表达TREM-2能使BMDMs对E.coli的吞噬能力提高,但对胞内吞噬体清除和杀菌均无显著影响。在E.coli肺炎模型中,回输过表达TREM-2的WT的BMDMs显著改善小鼠的生存率,减少感染12小时后BALF中的细菌负荷和肺组织损伤程度以及肺血管通透性,并显著减轻BALF中炎症因子IL-1β的水平,但不影响BALF中TNF-α的水平。回输过表达TREM-2的Cybb-/-的BMDMs,对小鼠生存率、BALF中的细菌负荷以及IL-1β和TNF-α的水平均无显著影响。研究结论:TREM-2增强巨噬细胞对E.coli的吞噬与杀灭作用,从而改善大肠杆菌肺炎小鼠的预后,这种保护作用依赖于NADPH来源的ROS的正常活性。第二部分巨噬细胞TREM-2通过调控线粒体ROS水平影响炎性体活化及细胞命运研究目的:巨噬细胞吞噬细菌后,吞噬体质膜上的NADPH氧化酶复合体聚合活化,产生大量ROS用以杀菌;同时由于感染导致的氧化应激,巨噬细胞内的线粒体也产生大量的ROS。不同细胞器来源的ROS在巨噬细胞免疫防御中的作用可能不尽相同。已有的研究表明,线粒体来源的ROS不仅具有杀菌作用,而且能引发细胞的炎性死亡（焦亡;pyroptosis）。第一部分的研究发现过表达TREM-2的BMDMs对E.coli的吞噬和杀菌作用都是增强的,而且这种效应依赖于NADPH氧化酶来源的ROS。因此,本部分研究将探讨TREM-2对巨噬细胞线粒体氧化应激、炎性体活化和细胞焦亡的调控作用。研究方法:体外培养WT的BMDMs,分别转染过表达TREM-2的腺病毒或过表达GFP的腺病毒（对照组）,经E.coli刺激不同时间点（0、1、2、3、6、9、12小时）后,采用流式细胞术检测两组BMDMs线粒体ROS的产生情况;采用透射电子显微镜观察在细菌感染状态下两组BMDMs胞内线粒体超微结构的变化情况;采用流式细胞术检测经E.coli刺激后两组BMDMs胞内线粒体膜电位的变化。采用线粒体特异性超氧化物歧化酶处理后观察两组BMDMs对E.coli杀菌能力的变化。过表达TREM-2或对照GFP的WT的BMDMs经E.coli感染12小时后,采用免疫印迹法检测Caspase-1/Caspase-11炎性体和GSDMD、IL-1β的活化水平,并检测细胞上清中LDH的释放水平;采用流式细胞术检测细胞的焦亡程度;采用酶联免疫吸附法检测细胞上清中IL-1β和TNF-a的分泌水平。两组细胞经线粒体特异性超氧化物歧化酶处理和E.coli感染,观察经典炎性体的活化情况、LDH的释放变化和细胞上清中IL-1β的水平。采用气管滴注大肠杆菌的方法在WT小鼠（6-8周、雄性）制备大肠杆菌肺炎模型,3小时后经气管回输过表达TREM-2或GFP的Nlrp3-/-、Caspase1-/-或Caspase11-/-的BMDMs,观察小鼠生存率、BALF中细菌负荷以及IL-1β和TNF-α的水平。研究结果:与对照BMDMs相比,过表达TREM-2的WT的BMDMs在E.coli刺激6、9和12小时后线粒体ROS的产生明显减少;在E.coli感染6小时后,对照BMDMs的线粒体出现明显的超微结构损伤,如线粒体嵴的减少与消失、线粒体的空化现象;在E.coli刺激12小时后,对照BMDMs的线粒体膜电位较过表达TREM-2的BMDMs明显降低。但是,抑制线粒体ROS的产生并不影响过表达TREM-2的BMDMs的杀菌功能。进一步,过表达TREM-2的WT的BMDMs在E.coli刺激后Caspase-1的活化、GSDM-D的活化以及IL-1β的产生明显减弱,LDH释放减少,细胞焦亡显著减少,而Caspase-11不发生活化。而且,采用线粒体特异性的ROS抑制剂预处理细胞并经E.coli感染后,Caspase-1的活化、IL-1β的产生和LDH的释放明显降低。在E.coli肺炎模型中,给予WT小鼠回输过表达TREM-2或对照GFP的Nlrp3-/-或Caspase1-/-的BMDMs后,两组小鼠的生存率、BALF中的细菌负荷以及IL-1β和TNF-α的水平均无明显差异;回输过表达TREM-2的Caspase11-/-的BMDMs相比于回输表达GFP的Caspase11-/-的BMDMs能明显提高小鼠的生存率、降低BALF中的细菌负荷和抑制IL-1β的释放。研究结论:在E.coli感染时,过表达TREM-2的BMDMs可以抑制线粒体ROS的产生,维持线粒体的正常形态结构与膜完整性,抑制下游经典炎性体的活化,阻止细胞发生焦亡,并抑制炎症因子IL-1β的释放,从而有效改善E.coli肺炎小鼠的预后。第三部分单核细胞TREM-2表达水平与细菌性脓毒症患者预后的相关性分析研究目的:第一部分和第二部分的研究发现在细菌感染状态下TREM-2对巨噬细胞中不同细胞器来源的ROS的产生有不同的调节作用,并深入阐述了TREM-2对巨噬细胞抗感染免疫和细胞命运的协同调控作用。本部分研究将在临床细菌性脓毒症患者中进一步证实单核细胞TREM-2的表达和NADPH氧化酶水平、Caspase-1炎性体的活化以及患者疾病严重程度之间的相关性。研究方法:将2019年8月至2020年6月期间收入浙江大学附属第一医院重症监护病房（ICU）的细菌性脓毒症患者纳入本研究中。研究经医院伦理委员会批准并签署知情同意书。脓毒症的诊断标准参照sepsis 3.0指南,并将年龄＜18周岁的患者,患有免疫缺陷病毒感染,癌症,4周内进行过化疗、免疫抑制治疗和激素治疗以及无法签订知情同意的患者均予以排除。患者外周血样本均于收入ICU后24小时内采集。同时,记录收入患者的APACHEⅡ（Acute Physiology and Chronic Health EvaluationⅡ）评分和SOFA（Sequential Organ Failure Assessment）评分,感染部位,ICU停留天数以及住院天数、患者28天死亡率。采用流式细胞术分析外周血单核细胞TREM-2表达水平和Csapase-1活化水平,并进行相关性分析。采用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞并经贴壁培养后得到单核细胞,提取总RNA,采用定量PCR法检测TREM-2与NADPH氧化酶活性成分NOX-2的表达水平,并进行相关性分析。进一步,分析单核细胞TREM-2的表达水平与患者疾病严重程度之间的相关性。研究结果:本部分研究共纳入20例细菌性脓毒症患者,平均年龄55.6岁,15名男性患者,5名女性患者。患者入ICU时平均APACHEⅡ评分18.8分,SOFA评分10.2分,感染部位主要为肺部感染与腹腔感染。纳入患者的平均ICU住院时长为10.5天,28天生存率为80%。在细菌性脓毒症患者中,外周血单核细胞TREM-2的表达水平与NADPH活性成分NOX-2的表达水平呈正相关（r=0.86,P＜0.001）;TREM-2的表达水平与Caspase-1炎性体的活化呈负相关（r=-0.71,P＜0.001）。而且,外周血单核细胞TREM-2的表达水平与脓毒症患者入ICU时的APACHEⅡ评分呈负相关（r=-0.50,P＜0.05）。研究结论:脓毒症患者外周血单核细胞TREM-2的表达可能与巨噬细胞杀菌能力呈正相关,而与Caspase-1炎性体的活化、以及患者的疾病严重程度呈负相关,提示TREM-2可能是脓毒症预警的重要生物标记物和免疫调节治疗的新靶标。