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背景流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)是通过蚊虫叮咬感染乙脑病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的人兽共患传染病,表现为急性神经系统感染症状,该病主要威胁儿童。JE病死率达到30%-40%,存活者40%留有神经系统后遗症,对人类健康造成极大的威胁。全世界约有30亿人生活在JE流行区,目前JE主要流行于亚洲大部分地区,我国是JE高流行区。1993～2009年我国在长江流域三峡地区修建水库,按大坝正常蓄水位175m,淹没重庆和湖北省的19个县市(区),造成涉及人口约1590万人、总面积为5.6万平方公里的三峡库区。水库蓄水前这一地区是JE的高流行区,并存在骚扰阿蚊、中华按蚊、三带喙库蚊等多种JE的传播媒介。三峡建坝蓄水后,库区境内河流将改变天然急流的自然特征,水体流速减缓,自净能力降低,加上消落区污染物滞留累积,容易为蚊虫的孳生繁殖带来适宜的环境。三峡库区生态环境发生巨大的变化后,自然界JE的主要传播媒介蚊虫、JE中间宿主猪,以及人群的JEV感染状况急需重新评估,以了解水库环境变化对JE流行的潜在及中长期影响。目的通过对三峡库区采集的蚊虫、仔猪血清和正常人血清标本的实验室检测,了解蚊虫JEV感染率和JE中间宿主猪的JEV感染状况,并掌握正常人群JEV中和抗体水平,为三峡库区JE的预防控制提供病原学依据和本底资料。方法2008～2009年夏天在三峡库区采集蚊虫、仔猪血清和正常人血清标本,标本液氮保存运送至实验室。蚊虫标本研磨后制备cDNA文库,采用半巢式PCR法检测JEV基因,使用PooledInfRateManual软件计算蚊虫JEV感染率；同时将蚊虫研磨液接种于组织细胞培养,阳性分离物使用血清学和分子生物学技术进行鉴定。对新分离JEV的特异性基因片段扩增测序后,使用ClustalX1.83、MegAlign、Mega4和Genedoc3.2等生物学软件进行核苷酸和氨基酸序列分析及系统进化分析。仔猪血清标本分别采用ELISA法和IFA法检测IgG抗体和IgM抗体。正常人血清标本采用蚀斑减少中和实验法检测JEV中和抗体。结果1.本研究于2008～2009年连续两年分别在三峡库区三个监测点采集蚊虫标本,三个监测点自北向南依次为湖北省秭归县、重庆市万州区和渝北区。两年共采集到14183只蚊虫标本,分装为286批,蚊种包括3属4种,为三带喙库蚊、致倦库蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊。三个监测点两年所采集的蚊虫种类和数量基本相同,但各地优势蚊种存在差异,湖北省秭归县以骚扰阿蚊为优势蚊种,占当地所采集标本的86.34%(3932／4554),重庆市万州区和渝北区则以三带喙库蚊为优势蚊种,分别占当地所采集标本的57.35%(2859／4985)和76.77%(3565／4644)。三个监测点均采集到三带喙库蚊,但自北向南分布存在递增趋势,湖北省秭归县、重庆市万州区和渝北区三带喙库蚊的构成比分别为10.91%(497／4554)、57.35%(2859／4985)和76.77%(3565／4644)2.2008年采集的123批蚊虫标本中检出JEV核酸阳性23份,2009年采集的163批蚊虫标本中检出JEV核酸阳性26份。从JEV核酸检测阳性的蚊虫分析可以看出三带喙库蚊的JEV感染率最高,也最为普遍。两年每个监测点采集的三带喙库蚊均有JEV感染,并且自北向南呈现递减趋势,2008年和2009年其感染率分别为39.23和31.7／1000只蚊(秭归),10.58和3.60／1000只蚊(万州),4.17和3.66／1000只蚊(渝北)。致倦库蚊仅2009年在重庆市万州区和渝北区采集到少量,其感染率分别是16.09和0／1000只蚊。中华按蚊JEV感染率也较高,但仅从2009年在湖北省秭归县和重庆市万州区采集的中华按蚊中检测到JEV,其感染率为16.32和8.22／1000只蚊。骚扰阿蚊的JEV感染率最低,2008年仅在重庆市万州区采集的骚扰阿蚊中检测到JEV,其感染率为1.08／1000只蚊,2009年重庆市万州区和湖北省秭归县采集的骚扰阿蚊JEV感染率为2.79和1.35／1000只蚊。由此可见,四种蚊虫均有不同程度的JEV感染,其中三带喙库蚊JEV感染率最高,骚扰阿蚊最低。3.通过组织细胞培养法对2008～2009年采集的蚊虫标本进行病毒分离,结果从286批蚊虫研磨上清中分离到22株病毒阳性分离物。血清学和分子生物学鉴定结果显示,16株分离物为JEV,其中一株同时存在JEV和盖塔病毒(Getah virus, GETV),另外6株为GETV。基于E基因核苷酸序列的系统进化分析显示,三峡库区分离的16株JEV均属于基因Ⅰ型,大部分分离株与2004年四川省蚊虫标本的JEV分离株进化关系较近。16株JEV与JE减毒活疫苗SA14-14-2株在E基因区段存在14处共同的氨基酸差异位点,但决定抗原性和毒力的重要位点未发生变化。新分离7株GETV的3’UTR基因区段全长均为401nt,均存在GETV特有的长约53nt的3个重复序列元件和19nt的保守序列,第45～54nt间都存在与我国其它省分离株及蒙古和俄罗斯分离株一致的10nt缺失。4.为了解三峡库区猪感染JEV的状况,2008～2009年5月21日～6月14日在三峡库区共采集216份仔猪血清标本。血清学检测结果显示,两年仔猪血清标本JEV IgG抗体阳性率分别是48.76%(59／121)和89.47%(85／95),IgM抗体阳性率分别是46.28%(56／121)和38.95%(37／95),提示三峡库区仔猪JEV IgG抗体50%转阳时间大约在5-6月。结合标本采集时间和抗体检测结果估算IgG抗体50%转阳时间显示,2009年重庆市万州区、涪陵区和渝北区自北向南存在递早趋势,分别是6月9日±5日、5月23日±5日和5月16日±5日。2008年的结果此趋势不明显,重庆市万州区IgG抗体50%转阳时间比较早,可能原因为该监测点的仔猪饲养模式为猪场圈养,其他均为散户散养,圈养猪的抗体阳性率高于散养猪(χ2=43.797,P<0.05)。5.连续两年在三峡库区三个监测点采集正常人血清标本,共采集1222份。湖北省兴山县、重庆市万州区和渝北区分别采集了533份、496份和193份。2008～2009年连续两年调查结果显示,三峡库区正常人血清JEV中和抗体总阳性率为71.36%(872／1222),湖北省秭归县为57.04%(304／533)、重庆市万州区为81.05%(402／496)、渝北区为86.01%(166／193)。三个监测点自北向南JEV中和抗体阳性率呈现递增趋势,其差别部分与标本的年龄分布有关。按年龄分组分析结果显示,湖北省兴山县2008年标本为大于30岁的成人,其抗体阳性率为91.18%(93／102),2009年标本为小于16岁的儿童,其抗体阳性率为48.91%(211／431)；重庆市万州区两年抗体阳性率基本相同,分别为79.17%(190／240)和82.81%(212／256),大于10岁的人群两年抗体阳性率均高于90%,小于10岁的儿童两年抗体阳性率分别是48.89%(44／90)和53.40%(47／88),并且随年龄的增长呈现增高趋势,2008年0-、1-、5-三个年龄组的抗体阳性率分别是36.67%(11／30)、46.67%(14／30)和63.33%(19／30),2009年结果为0%(0／22)、65.63%(21／32)和76.47%(26／34),趋势基本一致；重庆市渝北区两年均以大年龄组人群为主,其抗体阳性率分别是75%(72／96)和96.91%(94／97),检测结果基本相似。由此可见,三峡库区儿童的JEV抗体水平低,是重点关注人群。结论本研究首次在三峡库区比较系统而全面地进行了JEV传播媒介蚊虫,病毒扩散的中间宿主猪,以及人群的JEV感染状况调查。三个监测点在三峡大坝自北向南依次间隔200公里,基本代表三峡库区的地理范围。该地区三带喙库蚊感染JEV最高最普遍,其次为中华按蚊,值得特别关注。该地目前JEV流行株为基因Ⅰ型,与SA14-14-2疫苗株存在一定的氨基酸差异位点,但决定抗原性和毒力的重要位点未发生变化,理论上目前广泛使用的疫苗株能有效预防该病毒引起的感染。当地仔猪自然感染JEV时间早,仔猪JEV IgG抗体50%转阳时间大约在5-6月,发现圈养猪抗体阳性率高于散养猪,有待继续监测和评估。三峡库区大年龄组人群JEV中和抗体水平高,可能与多次JEV隐性感染有关,小于10岁儿童JEV中和抗体水平低,提示当地适龄儿童的JEV疫苗接种率尚需提高,同时应加强防蚊灭蚊意识,以降低JE的发病率。