聚乳酸基支架制备及其纳米拓扑结构与细胞相互作用研究

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本文采用超临界二氧化碳(supercritical carbon dioxide, SC-CO2)辅助相分离技术,结合碳酸氢铵(ammonium bicarbonate, AB)颗粒为致孔剂,制备具有不同纳米拓扑结构的左旋聚乳酸(poly-L-lactide, PLLA)基支架,并考察了其不同纳米结构与细胞的相互作用情况。主要工作概括如下:首先,分别采用二氯甲烷、二氧六环及两者1:1(v:v)混合溶剂溶解PLLA,浓度为10%(w/v),致孔剂的使用量为AB/PLLA20:1(w:w),制备宏观尺寸为直径14mm、厚度3mm的不同结构支架,扫描电子显微镜观察发现支架分别呈大孔薄壁、均一纤维丝、大小孔并存网状结构。支架具有高孔隙率(94%)和极低的有机溶剂残留(二氯甲烷12ppm,二氧六环17ppm)。采用Alamar Blue法考察支架的细胞毒性,结果显示制备的支架细胞毒性低,属合格水平。动态凝血实验表明,PLLA支架材料比对照组(玻片)具有更好的抗凝血性能。其次,考察了不同纳米拓扑结构支架对L929及MC3T3-E1的黏附、增殖以及蛋白分泌情况。结果显示MC3T3-E1在混合溶剂组中的黏附率最大,二氧六环组中最小,二者有显著性差异(P<0.05);随着培养时间延长至第5天后,支架中的细胞均有增殖,然而,到第7天时,二氧六环组细胞数量减少,二氯甲烷组数量改变不明显,混合溶剂组细胞能缓慢增殖;Bradford试剂检测支架中细胞蛋白分泌总量,结果显示,混合溶剂组中细胞蛋白分泌总量最多,二氧六环组中最少。相较于MC3T3-E1,L929在三种结构中黏附率均增大,然而细胞增殖速率比MC3T3-E1小;三种结构中细胞蛋白分泌量总体水平比MC3T3-E1高。初步实验结果得出,混合溶剂组支架较利于细胞生长,在此结构支架中复合不同量丝素(silk fibroin, SF)纳米颗粒,分别为PLLA/SF(w/w)9:1、8:2、7:3,考察SF的加入对细胞行为的影响。结果显示,SF的加入能够提高材料的亲水性及与细胞的亲和性,可以提高支架对MC3T3-E1的黏附率;随着培养时间的延长,SF含量20%组能持续增殖,SF含量30%组细胞数量减少,SF含量10%组细胞数量改变不明显。相较于不含SF的支架中细胞蛋白分泌量,含SF的支架中细胞蛋白分泌量增加。与MC3T3-E1相反,SF加入反而降低了L929的黏附率,然而,L929在含SF支架中增殖更迅速,细胞蛋白分泌总量也进一步增加。综合分析得出,SF含量为20%时,较利于细胞的生长。然后,选出二氯甲烷组、混合溶剂组以及SF含量20%组的支架,探究其体外构建骨组织的潜能性。考察确定成骨诱导液条件,在支架中种植MC3T3-E1,培养7、14、21天后,微板法检测细胞中碱性磷酸酶活力,酶联免疫法测定细胞的骨钙素及Ι型胶原的分泌量。结果显示,SF含量20%的支架中细胞碱性磷酸酶活力最强,分泌骨钙素及Ι型胶原最多。最后,考察了支架的体外降解能力。实验表明,含SF的支架降解速率显著大于纯PLLA支架;降解初期的2个月内,混合溶剂组PLLA支架的降解速率小于二氯甲烷组PLLA支架,2个月后,降解速率高于二氯甲烷组PLLA支架。
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