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目的:1.探寻PEDF过表达的ADSCs在高糖环境中,对ADSCs细胞生存及蛋白质表达的变化情况。为利用ADSCs及PEDF-ADSCs治疗糖尿病源性阴茎勃起功能障碍提供前期基础研究。2.建立糖尿病阴茎勃起功能障碍大鼠模型,通过对大鼠模型移植注射ADSCs及PEDF-ADSCs,评估糖尿病阴茎勃起功能障碍大鼠模型阴茎海绵体勃起功能恢复情况,并探寻其分子生物学机制。方法:1.为研究ADSCs及PEDF-ADSCs对阴茎勃起功能的恢复的作用,课题组在前期细胞实验中将SD大鼠脂肪组织中分离ADSCs,在鉴定ADSCs分离成功后,将重组PEDF质粒转染入ADSCs中,使其过表达。随后将PEDF-ADSCs暴露于高葡萄糖环境中72小时后,通过Western来检测PEDF-ADSCs在高糖环境中,其TLR4相关的氧化应激蛋NOX1/4表达、凋亡相关蛋白切割的capsase3蛋白及切割的PARP表达水平以及神经营养因子BDNF、NGF及nNOS表达水平,运用ELISA法分析PEDF-ADSCs在高糖环境中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1 β表达情况,利用免疫荧光法来测定高血糖环境中其细胞中ROS水平,运用流式细胞仪分析双标记膜联蛋白V-FITC和PI的细胞研究PEDF-ADSCs在高糖环境中细胞凋亡相关情况,并用MTT法分析其细胞的分化发育能力。2.为进一步研究ADSCs与PEDF-ADSCs对糖尿病阴茎勃起功能障碍大鼠模型阴茎海绵体勃起功能的影响,在动物实验中对链脲菌素介导的糖尿病大鼠模型阴茎海绵体内注射ADSCs和PEDF-ADSCs。两周以后,通过测量实验大鼠模型的阴茎海绵体内压(ICP)及平均动脉压(MAP)来评估实验动物的阴茎勃起功能情况,之后再获取动物模型的阴茎海绵体组织用来做进一步实验。利用TUNEL分析了解PEDF过度表达的ADSCs在高血糖所介导的细胞凋亡情况,并运用Wentern blot法及ELISA法等一系列实验手段探寻其在高糖环境下cGMP浓度、神经营养因子的表达、炎症细胞因子及氧化应激相关蛋白的表达情况。结果:1.课题组在离体大鼠ADSCs细胞中使PEDF过度表达,观察细胞在高血糖环境中生存情况并验证其生物学效应,实验发现PEDF可以抑制TLR5介导的氧化应激相关蛋白NOX1/4的表达、抑制产生大量ROS从而抑制了高糖诱导的氧化应激、抑制了高糖对细胞活力的影响、通过抑制凋亡相关蛋白的表达从而对细胞凋亡具有有抑制作用、促进神经营养因子BDNF、NGF和nNOS等的表达、减少炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β等表达。2.为进一步研究ADSCs与PEDF-ADSCs对糖尿病阴茎勃起功能障碍大鼠模型阴茎海绵体勃起功能的影响,在动物实验中对链脲菌素介导的糖尿病大鼠模型阴茎海绵体内注射ADSCs和PEDF-ADSCs。两周以后,通过测量实验大鼠模型的阴茎海绵体内压(ICP)及平均动脉压(MAP),并计算其ICP/MAP比值,来评估实验动物的阴茎勃起功能情况。之后再获取动物模型的阴茎海绵体组织用来做进一步实验。利用TUNEL分析了解PEDF过度表达的ADSCs在高血糖所介导的细胞凋亡情况,并运用Wentern blot法及ELISA法等一系列实验手段探寻其在高糖环境下cGMP浓度、神经营养因子BDNF、NGF及nNOS的表达、炎症细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1 β及氧化应激相关蛋白ROS的表达情况。结论:1.PEDF转染的ADSCs在高糖环境中,可抑制ADSCs在高糖环境中氧化应激相关蛋白、炎症因子及细胞凋亡相关蛋白的表达及促进神经营养因子表达。2.在糖尿病阴茎勃起功能障碍大鼠模型中ADSCs及PEDF-ADSCs是通过提高cGMP浓度,刺激神经营养因子的表达上调以及抑制细胞凋亡相关蛋白、炎症细胞因子及氧化应激相关蛋白表达来发挥它的生物学效应。因此课题组可推断ADSCs和PEDF过度表达的ADSCs对治疗阴茎勃起功能障碍的具有发展前景。