随着我国现代化经济的不断发展,大气污染已经逐渐成为影响公众健康的首要环境危险因素之一。大气污染物是一组复杂的混合污染物,其中与人群健康效应关系最为密切的是可吸入颗粒物(inhalable particulate matter,IP),它是一种粒径小于10微米的颗粒物或飘尘。大气污染可引起人类呼吸系统疾病,研究显示呼吸道病毒主要通过附着于可吸入颗粒物表面被吸入肺内,引起各种感染性呼吸系统疾病。普通型感冒是最常见的感染性呼吸系统疾病,约有一半以上的普通型感冒是由鼻病毒(Rhinovirus,RV)感染造成的。另外有研究发现,RV感染除可以引起中耳炎、鼻窦炎等典型症状外,还可引起下呼吸道感染症状,如喘息、小气道阻塞、支气管炎及肺炎:同时伴有哮喘的小孩和成人被RV感染后可导致哮喘加剧。每年我国用于治疗普通型感冒及感染性肺部疾病的经济损失不断增加,因此,预防及治疗RV感染引起的相关疾病已成为不可忽视的公共卫生问题之一。　　 RV是一种直径约30nm,无包被的正链RNA病毒。目前已经发现超过100多种血清型,除RV87(一种错误分类的肠道病毒)外,其他血清型按照细胞识别受体不同可分为两类(Major group和Minor group),Major group RV主要被细胞表面ICAM-1(intercellular adhesion molecule1)识别,而Minor group RV的细胞表面的受体是低密度脂蛋白受体家族(low-densitylipoprotein receptor family)。当RV随着可吸入颗粒物进入呼吸道时,与呼吸道上皮细胞表面受体结合,通过内涵体模式进入细胞内;激活下游信号转导通路,诱导核转录因子NF-κB、IRF3磷酸化进入细胞核内,介导细胞分泌干扰素IFNβ、IFNλ1、IFNλ2/3等直接作用于进入呼吸道内的病毒颗粒,诱导前炎症因子IL6,IL8,CXCL10等募集其他炎症细胞如淋巴细胞,中性粒细胞等进入炎症部位,启动及调控适应性免疫反应。(见图一)　　 图一:　　 目前我国是世界吸烟人口最多的国家,占世界吸烟人口的1/4。中国疾控中心公布的一项调查结果显示,我国15岁及以上人群的吸烟率占28.1％,吸烟者总数达3亿人,吸烟问题已经成为我国较为严重的公共卫生问题。吸烟是多种慢性疾病(肿瘤、心血管疾病、慢性阻塞性肺疾病等)发病及死亡的主要危险因素之一,同时也有证据显示,无论是主动吸烟还是被动吸烟,都会减弱肺和呼吸道对病毒和细菌的抵抗力。流行病学研究发现,吸烟可以加重上呼吸道感染症状,延长其痊愈周期。因此,研究呼吸道上皮细胞抵抗鼻病毒的免疫学过程及吸烟是如何减弱这一过程,对预防和治疗吸烟人群中RV感染造成的普通型感冒、哮喘及肿炎具有重要的实际意义。　　 实验方法：　　 一、A549,NCIH292,BEAS-2B等呼吸道上皮细胞系及呼吸道上皮原代细胞分组及处理　　 将处于对数生长期的A549,NCIH292,BEAs-2B等呼吸道上皮细胞系及呼吸道上皮原代细胞按空白对照组(CON组)和鼻病毒感染组(RV16组)分组,按照感染复数(MOI=10)加入鼻病毒,培养48小时后,收集细胞总RNA及总蛋白,Realtime-PCR和Western Blot方法检测细胞因子及前炎症因子基因水平变化及NF-κB和IRF3信号转导通路的激活情况。　　 二、基因干扰TRIF,IPS-1探索TLR3及RLRs途径RV感染的免疫学机制研究的细胞分组及处理　　 将处于对数生长期的气道原代上皮细胞按非特异性基因干扰(SiRNA＃1)组、SiRNA＃1+RV16组、特异性基因干扰TRIF(SiTRIF)组、SiTRIF+RV16组、特异性基因干扰IPS-1(SiIPS-1)组、SiIPS-I+RV16组分组。首先将处于对数生长期气道原代上皮细胞按照4×105/孔接种于6孔板中,24小时后,细胞分别转染SiRNA＃1、SiTRIF、SiIPS-1,37℃、5％CO2培养箱孵育18小时后,更换新鲜培养基继续培养6小时,按感染复数(MOI=10)加入鼻病毒RVl6,37℃,5％CO2培养箱孵育48小时,收集细胞总RNA及总蛋白,Realtime-PCR和Western Blot方法检测病毒在细胞中复制情况、抗病毒细胞因子IFNβ,IFNλ1,IFNλ2/3和前炎症因子IL6,IL8的分泌情况及NF-κB和IRF3信号转导通路的激活情况。　　 三、病毒及病毒模拟物Poly(I:C)处理细胞后,细胞内接头蛋白　　 TRIF降解实验的细胞分组及处理　　 1)气道上皮细胞系NCIH292、BEAS-2B及气道原代上皮细胞(Human BronchiaEpithelium,HBE)、Jurket、Hela、Human-Fibroblast细胞分为Poly(I:C)非处理组.空白对照组(CON组)和Poly(I:C)处理组。首先将处于对数生长期的NCIH292、BEAS-2B、气道原代上皮细胞(Human Bronchia Epithelium,HBE)、Jurket、Hela、Human-Fibroblast细胞按照4×105孔接种于6孔板中,24小时后,按25μg/ml加入Poly(I:C),37℃,5％CO2培养箱孵育3小时,收集细胞总蛋白,Western Blot检测细胞内接头蛋白TRIF降解情况。　　 2)气道上皮细胞系NCIH292细胞(1)将处于对数生长期的NCIH292细胞分为Poly(I:C)非处理组-空白对照组(CON组)、Poly(1:C)25μg/ml、2.5μg/ml、0.25μg/ml、0.025μg/ml处理组。首先将处于对数生长期的NCIH292细胞按照4×105/孔接种于6孔板中,24小时后,分别按25μg/ml、2.5μg/ml、0.25μg/ml、0.025μg/ml加入Poly(I:C),37℃,5％CO2培养箱孵育3小时,收集细胞总蛋白,Western Blot方法检测细胞内接头蛋白TRIF降解情况。(2)将处于对数生长期的NCIH292细胞分为Poly(I:C)非处理组-空白对照组(CON组)、Poly(I:C)25μg/ml20分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时处理组。首先将处于对数生长期的NCIH292细胞按照4×105/孔接种于6孔板中,24小时后,按25μg/ml加入Poly(I:C),37℃,5％CO2培养箱孵育20分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时,收集细胞总蛋白,Western Blot方法检测细胞接头蛋白TRIF降解情况。　　 四、蛋白酶抑制剂抑制TRIF降解实验的细胞分组及处理　　 将处于对数生长期的气道上皮细胞系NCIH292、BEAS-2B细胞预先给予MG132、Caspase Inhibitor-1、Dynasore及Chloriquine抑制剂处理1小时,再将细胞分为空白对照组(CON组)、Poly(I:C)处理组,按25μg/ml加入Poly(I:C),37℃,5％CO2培养箱孵育3小时,收集细胞总蛋白,Western Blot方法检测细胞内接头蛋白TRIF降解情况。　　 五、TRIF降解后干扰素诱导途径无应答实验研究中细胞分组及处理。　　 气道上皮细胞系NCIH292分为Poly(I:C)非处理组-空白对照组(CON组)、前6小时培养基孵育+后3小时Poly(I:C)处理组(6h MEDIUM+3h DSR)、前6小时给予Poly(I:C)后换培养基重新给予Poly(I:C)处理组(6h DSR+3h DSR)、给予Poly(I:C)处理9小时组(9h DSR)。首先将处于对数生长期的NCIH292细胞按照4×105/孔接种于6孔板中,24小时后,按上述各组时间要求给予Poly(I:C)25μg/ml,37℃,5％CO2培养箱孵育9小时,收集细胞总RNA及细胞培养液,Realtime PCR和ELISA方法检测细胞因子及前炎症因子的基因和蛋白水平的变化。　　 六、香烟烟雾提取物的制备　　 取一支装有10ml细胞培养液50ml离心管备用,用60ml注射器从香烟尾部分七次缓慢抽取50ml香烟气态燃烧物,缓慢注入含有细胞培养液的离心管中,反复剧烈震荡1分钟;待培养液变成香烟烟雾提取物饱和溶液后,过滤除菌,香烟烟雾提取物CSE采用305nm处OD值标准化。将CSE饱和溶液倍比稀释后测定305nm处OD值。每次试验选取OD=0.015的CSE浓度处理细胞。　　 七、细胞预先给予CSE处理后,再给予鼻病毒处理实验中细胞分组及处理　　 分为4组:1)香烟烟雾提取物非处理+鼻病毒(Rhinovirug,RV16)非感染组(CON组);2)香烟烟雾提取物非处理+鼻病毒感染组RV16组(RV16组);3)香烟烟雾提取物处理+鼻病毒(Rhinovirus,RV16)非感染组(CSE组);4)香烟烟雾提取物处理+鼻病毒(Rhinovirus,RV16)感染组(CSE+RV16组)。首先将处于对数生长期的A549细胞按照4×105/孔接种于6孔板中,24小时后,给予CSEOD=0.015处理,37℃,5％CO2培养箱孵育24小时后,按感染复数(MOI=10)加入鼻病毒RV16,37℃,5％CO2培养箱孵育48小时,收集细胞总RNA及总蛋白,Realtime-PCR和Western Blot方法检测病毒在细胞中复制情况、细胞因子IFNβ,IFNλ1,IFNλ2/3和前炎症因子IL6,IL8的分泌情况。　　 八、统计分析　　 全部数据采用SPSS13.0统计学软件进行分析,统计结果表示为mean±S.E.M.,采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异;当差异有统计学意义时,用SNK法进行组间比较,P＜0.05具有统计学意义。　　 实验结果：　　 一、气道上皮细胞主要通过激活核转录因子NF-κB和IRF3,介导细胞因子IFNβ,IFNλ1,IFNλ2/3和前炎症因子IL6,IL8等分泌来抵抗鼻病毒感染。　　 气道上皮细胞系A549、NCIH292细胞及气道上皮原代细胞鼻病毒感染增加细胞因子IFNβ,IFNλ1,IFNλ2/3和前炎症因子IL6,IL8 mRNA表达水平及激活NF-κB和IRF3信号转导通路。　　 二、气道上皮细胞受体TLR3及RLRs(retinoid acid likereceptors)信号转导途径在抵抗鼻病毒RV16感染效应中的免疫学机制研究。　　 气道上皮原代细胞基因干扰TRIF和IPS-1后,鼻病毒感染诱导细胞分泌抗病毒细胞因子IFNα,IFNλ1,IFNλ2/3和前炎症因子IL6通过TLR3-TRIF及RLRs-IPS-1两条受体信号转导途径完成,而诱导IL8 mRNA表达水平及细胞抵抗病毒复制主要依赖于TLR3-TRIF受体信号转导途径。　　 三、Poly(I:C)在气道上皮细胞系及原代细胞中均可诱导细胞内接头蛋白TRIF的降解。　　 气道上皮细胞系NCIH292、BEAS-2B及气道上皮原代细胞Poly(I:C)处理后,细胞内的TRIF被降解,该现象不仅发生在气道上皮细胞,在其他来源(Hela、Fibroblast等)细胞同样可以观察到该现象,且TRIF降解具有时间及浓度依赖性。　　 四、TRIF降解不依赖于蛋白酶体和凋亡过程,Dynasore和Chloriquine可以阻止其降解。　　 气道上皮细胞系NcIH292、BEAS-2B细胞预先给予蛋白酶体抑制剂MG132,凋亡过程抑制剂Caspase Inhibitor-1,初级内涵体形成抑制剂Dynasore及溶酶体酶抑制剂Chlorifquine后,再给予Poly(I:C)处理,Dynasore和Chloriquine可以干扰TRIF降解过程。　　 五、TRIF降解导致细胞对再次施加的Poly(I:C)处理因素干扰素诱导途径无应答效应。　　 当气道上皮细胞系NCIH292细胞给予Poly(I:C)处理6小时后,重新施加Poly(I:C)处理后,发现细胞分泌抗病毒细胞因子IFNβ,IFNλ1,IFNλ2/3与直接给予Poly(I:C)处理相比显著下降(P＜0.05),但细胞前炎症因子IL6、IP10mRNA表达水平及ELISA检测前炎症因子IL6、IL8的分泌水平并没有明显的下降。　　 六、鼻病毒在感染Hela细胞及气道上皮原代细胞中诱导TRIF降解。　　 Hela细胞及气道上皮原代细胞给予鼻病毒感染后,同样可以导致细胞内TRIF蛋白水平的降解。但呼吸道合胞病毒RSV不能诱导TRIF降解。　　 七、给予细胞香烟烟雾提取物改变细胞分泌前炎症因子及抗病毒细胞因子能力。　　 A549细胞预先给予香烟烟雾提取CSE处理24小时后,鼻病毒感染48小时发现CSE可以增加细胞前炎症因子IL6、IL8的分泌,但是抑制抗病毒细胞因子IFNB,IFNλ1,IFNλ2/3的分泌,是病毒在CSE处理后的细胞中复制水平增加,并通过western blot检测发现CSE可以导致细胞内TRIF蛋白水平的降解。　　 结论：　　 1、气道上皮细胞主要通过激活核转录因子NF-κB和IRE3,介导细胞因子IFNβ,IFNλ1,IFNλ2/3和前炎症因子IL6,IL8等分泌来抵抗鼻病毒感染。　　 2、鼻病毒感染气道上皮细胞诱导介导细胞因子IFNβ,IFNλ1,IFNλ2/3和前炎症因子IL6通过TLR3-TRIF及RLRs-IPS-1两受体信号转导途径,但鼻病毒感染诱导IL8分泌和抵抗鼻病毒在感染细胞中的复制过程则主要依赖于TLR3-TRIF受体信号转导途径。　　 3、鼻病毒感染及TLR3配体Poly(I:c)作用可导致TLR3信号转导途径中的接头蛋白TRIF降解,该过程不仅见于气道上皮细胞中,同样可发生在其他来源的细胞中。　　 4、TRIF降解不依赖于蛋白酶体和凋亡过程,Dynasore和Chloriquine可以阻止其降解。说明在自然过程中,降解TRIF是通过内涵体溶酶体途径进行的。　　 5、TRIF降解负性调节TLR3信号转导途径介导的抗病毒因子干扰素分泌。　　 6、香烟烟雾提取物刺激气道上皮细胞可减弱细胞分泌抗病毒细胞因子(IFNβ,IFNλ1,IFNλ2/3),促进上皮细胞分泌前炎症因子(IL6、IL8等)。减弱细胞抵抗鼻病毒感染能力,同时增加病毒感染局部炎症反映。　　 7、香烟烟雾提取物CSE作用细胞可导致TRIF降解,可能是吸烟造成细胞对鼻病毒感染的免疫应答减弱,鼻病毒复制水平升高的原因之一。