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共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid,CLA)是亚油酸(Linoleic Acid,LA)衍生的共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。它具有很多营养和保健功能,如抗癌、抗动脉粥样硬化和延缓机体免疫力衰退、减肥等。在共轭亚油酸的各种立体异构体中c9,t11-18:2被认为最具生物活性。乳酸菌生物转化共轭亚油酸是当前生物法转化共轭亚油酸研究的热点,为共轭亚油酸的合成提供了另一种有效的途径。
本文主要通过比较不同反应体系中植物乳杆菌ZS2058生物转化CLA的转化率,确定最适合的反应体系为静息态细胞在磷酸盐缓冲溶液中生物转化CLA。通过正交实验确定了最适合的反应条件为:底物浓度为3mg/mL,细胞浓度为4×10<10>cfu/mL,反应温度:37℃,pH6.0,转化时间24h。在此反应条件下,CLA转化率为31.76%。通过GC法和GC-MS法检测,发现反应过程中主要产生两个产物:CLA和羟基脂肪酸HY。产物CLA中c9,t11-CLA占96.60%,t10,c12-CLA占2.40%,还有少量其他异构体,说明亚油酸异构酶有高度的专一性。
根据植物乳杆菌ZS2058生物转化CLA的反应进程曲线以及转化机理探索实验可知,c9,t11-CLA是生物转化过程的反应中间体,其可能的反应机理是:第一步,LA在亚油酸异构酶的作用下异构化为CLA:第二步,c9,t11-CLA在水合酶的作用下进一步转化为羟基脂肪酸HY。
本文采用超声波破碎细胞获取亚油酸异构酶粗酶,最佳的破碎条件为:破碎功率320W,破碎工作时间为7.5min,菌悬液浓度11.25g/50mL,提取pH7.0,添加0.2mol/LNaCl溶液。并研究了亚油酸异构酶酶反应的最适条件为:pH7.5,温度37℃,LA浓度0.8mg/mL,酶液体积3mL以磷酸钠一柠檬酸缓冲溶液为反应介质,Ca<2+>,螯合剂1,10-菲哕啉和EGTA对LI粗酶没有明显的影响。酶液在4℃,pH7.5的磷酸钠一柠檬酸缓冲溶液中有较好的稳定性,酶液中添加20%甘油和0.2mol/LNaCl溶液有助于提高亚油酸异构酶的稳定性。
对亚油酸异构酶的分布进行了研究,通过改变离心速度,对收集到的不同部位进行酶活检测发现,酶活在菌体碎片,可溶蛋白和细胞膜中的分布比例分别为:26.53%,30.80%和42.67%。同时,粗酶液经过0.7%TritonX-100提取5h后,酶活能够提高3.47倍。由此可以知道亚油酸异构酶是一种膜结合酶,并且在菌体培养过程中添加LA能诱导其产生。