本文研究目的：构建G250抗原蛋白膜外段的真核表达重组体pcDNA3.1(+)-G250，用脂质体转染法将重组体转染CHO细胞表达目的蛋白，为G250的相关后续研究提供物质基础；同时将表达重组体作为核酸疫苗免疫小鼠，观察体液应答效果，为制备G250单抗及其基因疫苗的研究提供理论和实验基础。 研究方法：从肾癌组织终提取总RNA，逆转录为cDNA。根据GeneBank上G250序列(AJ010588)设计一对含XbaⅠ位点、HindⅢ位点的引物，PCR扩增G250抗原基因的膜外目的片段。PCR产物和真核表达载体pcDNA3.1(+)分别经双酶切后凝胶回收纯化，用T4酶连接，转化感受态大肠杆菌DH5α。从氨苄青霉素阳性的LB板上随机挑取单菌落，增菌并提取质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定，含有目的片段的为阳性重组子，采用自动序列分析仪对插入片段进行序列分析。 采用无菌操作提取并纯化G250-pcDNA3.1(+)质粒，用脂质体转染法转染入小鼠卵巢癌上皮细胞CHO细胞。转染后24小时用G418600ug/ml选择培养基培养，对G418抗性克隆用RT-PCR方法筛选鉴定阳性克隆，并扩大培养之。获得稳定生长并表达G250目的蛋白的阳性细胞株，用间接免疫荧光法检测表达的G250膜外段蛋白在细胞中的位置。提取细胞总蛋白，用Western-Blotting法鉴定转染细胞表达G250膜外段蛋白的分子量。 大量提取并纯化G250-pcDNA3.1(+)质粒，作为核酸疫苗注射入小鼠的后肢腓肠肌，进行核酸免疫。免疫4次后的小鼠血清作为一抗，肾癌标准细胞株786-0做抗原细胞，进行间接免疫荧光法检测。以此观察核酸免疫的体液免疫效果。 研究结果：从肾癌组织终提取总RNA经RT-PCR扩增，用1.0％琼脂糖凝胶电泳可见一条特异条带，位置在750bp和1000bp之间，其大小与预计片段大小基本一致，而阴性对照未见任何条带。阳性重组子经PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳可见目的条带，经双酶切后显示目的条带和5.4KB的pcDNA3.1(+)条带。序列测定结果与GeneBank上G250序列(AJ010588)进行Blast分析，相应片段的同源性为100％。 用脂质体转染法将重组质粒转染入小鼠卵巢癌上皮细胞CHO细胞，经筛选和鉴定得到两株稳定表达G250膜外片段的阳性转染细胞克隆，经RT-PCR证实转染细胞内存在G250膜外段的mRNA转录，间接免疫荧光法检测到转染细胞表达G250膜外段在CHO的细胞膜上。Western-Blotting法证实转染细胞表达蛋白的分子量约为32KD，与预计相符。 将重组质粒作为DNA疫苗免疫小鼠，取小鼠免疫血清，用肾癌标准细胞株786-0做间接免疫荧光法检测，结果呈阳性。且抗体稀释度可达1∶10。 研究结论： 1、利用RT-PCR技术成功扩增了G250膜外段编码区cDNA,经序列分析显示扩增的序列正确。 2、构建了G250膜外段真核表达载体，并建立了稳定表达目的蛋白的细胞株。表达的目的蛋白为G250抗原后续的相关研究提供物质基础。 3、构建的pcDNA3.1(+)-G250作为核酸疫苗免疫小鼠，经鉴定获得一定的体液免疫效果，为制备G250单抗及核酸疫苗的研发提供了理论和实验基础。