目的:据世卫组织调查显示,酒精性肝损伤的发病人数在逐年增加,对人们的健康存在极大的威胁。我国藏区治疗肝病的经典复方二十五味松石丸,用药广泛,疗效显著。根据文献可知,二十五味松石丸多基于少数民族地区的用药实践,药理作用涉及较少。存在基础研究薄弱、药理作用不明确等方面问题,距离现代化的研究水平还有一定的差距,本课题拟选用大鼠急性酒精性肝损伤及慢性酒精性肝损伤两种疾病模型,从改善急、慢性酒精性肝损伤模型大鼠的血清转氨酶及脂质指标,缓解肝脏组织抗氧化应激损伤及炎症反应,减少肝细胞损伤等方面,多模型、多角度、多层次、多途径综合分析藏药二十五味松石丸对肝脏的保护作用及机制,为藏药二十五味松石丸对急、慢性酒精性肝损伤的临床治疗提供实验参考及数据支持,同时为经典藏药后续的研究提供新的思路。方法:1.藏药二十五味松石丸对大鼠急性酒精性肝损伤的保护作用及机制研究:(1)建立大鼠急性酒精性肝损伤模型。(2)生化指标检测:运用酶联免疫吸附测定法(ELISA),检测血清指标AST、ALT,检测肝匀浆指标TC、TG、SOD、GSH、IL-1β、IL-6、TNF-α,依据试剂盒的说明进行检测,用酶标仪检测各指标水平。(3)蛋白因子表达量的测定:应用蛋白质印迹法(Western blot),测定大鼠肝脏组织凋亡蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3)的表达。(4)m RNA表达量的测定:运用PCR法检测肝脏组织m RNA表达量。(5)组织病理形态学:将肝脏组织固定、脱水、包埋、制片后,用苏木素-伊红(HE)染色处理,并在光学显微镜下观察拍摄。(6)肝脏指数计算及统计学分析。2.藏药二十五味松石丸对大鼠慢性酒精性肝损伤的保护作用及机制研究:(1)建立大鼠慢性酒精性肝损伤模型。(2)指标检测方法同上。结果:1.藏药二十五味松石丸对大鼠急性酒精性肝损伤的保护作用及机制研究:(1)一般行为学影响:灌酒1 h内,对各组大鼠行为状态进行观察,均呈醉酒状态,具体表现为反应缓慢、嗜睡呆滞,1h后上述状态得以缓解。造模结束后,模型组大鼠死亡2只,皮毛无光泽,其状态萎靡,活动量也逐渐减少,部分大鼠大便稀软。对照组大鼠死亡0只,饮水进食均正常,体质量明显增加。各给药组状态优于模型组。(2)肝脏指数及血清转氨酶水平影响:与模型组相比,给药组体质量增加、肝脏系数降低,其中以高剂量组效果最为显著,其次是中剂量组;高、中剂量组血清的ALT、AST水平均有不同程度的降低。(3)肝脏组织脂质水平及氧化损伤影响:与模型组相比,高、中剂量组大鼠血清TC及TG水平均有不同程度的下降。SOD、GSH水平均上升。(4)肝脏组织病理学影响:HE染色结果显示模型组肝汇管区周围少量的结缔组织胶原增生,并伴有较多的淋巴细胞浸润;肝窦微扩张,肝窦内枯否氏细胞增多;小叶内可见多处炎症灶浸润,胞质内圆形脂肪空泡;而给药组在不同程度上有效减少肝组织损伤程度。(5)肝脏组织炎症水平影响:与模型组比较,除二十五味松石丸低剂量组IL-6水平差异无统计学意义外,各组的IL-1β、IL-6、TNF-α含量降低。(6)肝脏组织凋亡相关蛋白表达的影响:与模型组比较,高剂量组、中剂量组的Bax、Caspase-3的表达降低;Bcl-2表达量升高。(7)对肝脏组织m RNA表达量的影响:与模型组相比,给药组大鼠肝脏组织匀浆液中Bax m RNA及Caspase-3 m RNA表达量均明显降低,而Bcl-2 m RNA表达量呈明显上升趋势(P<0.01)。2.藏药二十五味松石丸对大鼠慢性酒精性肝损伤的保护作用及机制研究:(1)一般行为学影响:灌酒1 h内,对各组大鼠行为状态进行观察,均呈醉酒状态,具体表现为反应缓慢、嗜睡呆滞,1h后上述状态得以缓解。造模结束后,模型组大鼠死亡2只,皮毛无光泽,并有严重脱毛现象,其活动量也逐渐减少,状态萎靡。试验期间,中、低剂量组各死亡一只,各给药组状态优于模型组。对照组大鼠死亡0只,饮水进食均正常,体质量明显增加。(2)肝脏指数及血清转氨酶水平影响:与模型组相比,给药组肝脏系数降低,其中高剂量组的效果最为明显(P<0.01)。高、中剂量组血清的ALT、AST水平均有不同程度的降低(P<0.01或P<0.05)。(3)肝脏组织脂质水平及氧化损伤影响:相对模型组,各给药组均能降低大鼠肝脏脂质TC及TG水平;相对模型组,阳性药及各给药组均能升高肝脏氧化损伤SOD、GSH水平(P<0.01),其中高剂量的升高幅度较大。(4)肝脏组织病理学影响:模型组组织中多见肝细胞胞核周围胞质减少,伴有较多肝细胞气球样变性及细胞肿胀;核居中,胞质空泡化,淋巴细胞浸润,肝窦被挤压消失;小叶内可见多处炎症灶浸润;阳性药组和高剂量组能缓解组织的损伤程度。(5)肝脏组织炎症水平影响:与模型组相比,阳性药多烯磷脂酰胆碱组、二十五味松石丸各剂量组大鼠肝脏组织匀浆液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著降低(P<0.01)。(6)肝脏组织凋亡相关蛋白表达的影响:与模型组比较,除二十五味松石丸低剂量组Bax、Bcl-2、Caspase-3水平差异无统计学意义(P>0.05)外,各组的Bax、Caspase-3水平表达显著降低(P<0.01或P<0.05)且Bcl-2表达量显著升高(P<0.01或P<0.05)。(7)对肝脏组织m RNA表达量的影响:与模型组相比,阳性药组、二十五味松石丸高剂量组大鼠肝脏组织匀浆液中Bax m RNA、Caspase-3 m RNA表达量均显著降低(P<0.05),而Bcl-2 m RNA表达量显著升高。结论:综上所述,藏药二十五味松石丸能够改善大鼠酒精性肝损伤的程度,对其具有一定的保护作用。可以改善由酒精引起的血清ALT和AST水平的异常升高;减少了TG和TC的异常增加并且促进了油脂代谢;显著提高抗氧化酶SOD活性和GSH水平,起到抗氧化损伤的保护作用;降低IL-1β、IL-6、TNF-α的水平缓解肝脏组织炎症反应;对肝损伤的护机制可能是通过降低Bax、Caspase-3的表达,升高Bcl-2表达量,减少肝细胞的凋亡;改善基因调控,下调Bax m RNA、Caspase-3 m RNA表达量降低,上调Bcl-2 m RNA表达量,从而缓解酒精性肝损伤。初步验证了饮酒前给予二十五味松石丸能减轻酒精对肝脏的伤害,改善大鼠急慢性酒精性肝损伤的程度,对肝脏具有一定的保护作用,其机制可能与降低酶活性改善肝脏代谢、改善脂质代谢水平、减轻氧化应激反应、降低炎症因子表达、抑制细胞凋亡有关。